Lékařská mikrobiologie MUDr. Alena Ševčíková Mikrobiologie •Mikrobiologie (z řeckého micron = malý, biologia = studium života) je věda studující mikroorganismy • –Virologie – 20 - 200nm –Bakteriologie - 1 μm –Mykologie - cca 10 μm –Parazitologie – 10 -150μm – Parazitologie zahrnuje nauku o prvo plísně pod mikroskopem Blechy P1010118 Mikrobiologie – –lékařská – zabývá se mikroorganismy, které jsou patogenní pro člověka, vyvolávají u něj onemocnění nebo se u člověka přirozeně vyskytují –veterinární –potravinářská – mikrobiologie potravin, jejich konzervace, využití v potravinářských technologiích – – – – • Bakteriologie •buňky prokaryotické •vždy jednobuněčné, netvoří tkáně •nukleoid (bakteriální obdoba jádra) –není obalen membránou •neobsahuje mitochondrie, ani endoplasmatické retikulum •součást buněčné stěny je peptidoglykan • • prokaryoticka_bunka_bakterie Stavba bakteriální buňky •Cytoplasma buňky obsahuje –nukleoid-jaderný ekvivalent, –tvořený cirkulární DNA –ribosomy a inkluzní tělíska, vakuoly, –plasmidy – malé molekuly DNA •Cytoplasmatická membrána •Buněčná stěna •Polysacharidová pouzdra nebo slizová vrstva – glykoprotein, chrání před fagocytózou •Bičíky – orgány pohybu a fimbrie – adheze bakterií k epitelu – – prokaryoticka_bunka_bakterie Buňky eukaryotické •Kvasinky a plísně • • •Jednobuněční prvoci, vícebuněční příživníci, členovci a červi (blecha, veš) • • •Rostliny •Živočichové • calbicanscsfvpshunt3000x Vši prvok Stručná historie •Stáří planety cca 4,5 miliardy let •Prokaryotické buňky – archea, bakterie cca 3,5 miliardy let •Eukaryotické buňky jednobuněčné – cca 2 miliardy let •Eukaryotické vícebuněčné organismy – cca 700 miliónů let •Obratlovci - cca 250 milionů let •Savci - cca 70 miliónů let •Člověk – 200 000 let – 500 000let • • • • • • Celá minulost planety zkrácená na velikost hodinového ciferníku Obor mikrobiologie • •1857 Louis Pasteur zformuloval teorii, že zkvašení vína je způsobeno mikroby a předpokládal, že stejným způsobem by mikroby mohly vyvolávat choroby a současně s Robertem Kochem prokázali •1876, že sněť slezinná může být vyvolána experimentálně vstříknutím bakterie Bacillus anthracis do těla zvířat • • • 300px-Tableau_Louis_Pasteur Érou Louise Pasteura a Roberta Kocha nastalo období označované jako zlatý věk mikrobiologie •Louis Pasteur (1822 – 1895) –očkování proti vzteklině, sněti slezinné, choleře drůbeže –příčina kvašení piva a vína, pasterizace –kultivace bakterií v tekutých půdách –objevil mikroby vytvářející spóry, anaeroby •Robert Koch (1843 – 1910) –zavedl izolaci čistých kultur na pevných půdách, barvení bakterií a mikrofotografii –podílel se na objevu původce cholery a izoloval původce tuberkulózy – – – • •Podle metod a postupů zavedených Pasteurem a Kochem byla postupně objevena většina původců bakteriálních infekcí • •1898 – objeven první živočišný virus •1911 – první lidský virus, žlutá zimnice •1915 – viry bakterií - bakteriofágy Nomenklatura – názvosloví •Pojmenování taxonu, bakteriálního druhu, podle mezinárodně dohodnutých pravidel •Název bakterií se skládá ze jména rodového •(rod, genus) a jména druhového (druh, species) –Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli • bakteriální druh (species) –soubor kmenů sdílejících stálé vlastnosti a lišící se od kmenů jiné skupiny •Kmen je populace mikrobů pocházející z jediné mikrobiální buňky • • Identifikace – určování •Postup, kterým zjistíme, že nově izolovaný kmen náleží do známého, pojmenovaného taxonu –morfologické znaky (tvar, velikost, uspořádání, barvitelnost buněk, vzhled kolonií) –fyziologické znaky (tvorba nebo štěpení různých sloučenin) –chemotaxonomické znaky (složení buněčné stěny, analýzy mastných kyselin) –genetické znaky a molekulární vlastnosti – Základní morfologie bakterií •Velikost – většina patogenů 0,5 – 3 μm •Tvar a uspořádání –koky ve dvojicích, řetízcích, shlucích, tetrádách –tyčinky –spirály •Barvitelnost dle Grama –grampozitivní - modré –gramnegativní – červené •dle acidorezistence • – • – • bakterie bakterie-5 Streptococcus sp. - Staphylococcus sp. staphylococcus_bacteria_phoyomicrographs_germs Buněčná stěna •Silná tuhá vrstva odolávající osmotickému tlaku a umožňující bakterii uchovat svůj tvar •Stěna grampozitivních bakterií je jednodušší a tvoří ji mohutná 20 nm silná peptidoglykanová struktura, protkaná řetězci kys.teichoové • P1010128 Buněčná stěna •Stěna gramnegativních je tenčí, ale složitější 15 nm – tenký peptidoglykan, proteiny tvořící poriny ve fosfolipidové dvojvrstvě, lipoproteiny, lipopolysacharidy, periplasmatický prostor (endotoxin, O antigen) • P1010133 Vnější vrstvy •Polysacharidové pouzdro (pneumokoky, klebsiely, hemofily) •Polypeptidové pouzdro (anthrax) •Slizová vrstva (Streptococcus mutans, koaguláza negativní stafylokoky) – biofilm •Bakteriální bičíky •Pili, fimbrie • • • Fig-1 Streptococcus%2520pneumoniae%2520fig11 Bakteriální spory •Rody Bacillus a Clostridium reagují na vysychání či úbytek živin tvorbou spor – vysoce odolné útvary, mohou přežívat stovky let při nepříznivých podmínkách •Bakteriální endospory nepřijímají Gramovo barvivo – světlolomné útvary •Tvar, velikost a uložení spor jsou někdy typické pro různé druhy •Clostridium tetani Clostridium1 Rozdělení mikrobů podle vztahu ke kyslíku •Aeroby: Pseudomonas, Vibrio, Mycobacterium •Anaeroby: –Obligátní,(striktní):Clostridium haemolyticum, Clostridium difficile –aerotolerantní: Clostridium perfringens •Fakultativní anaeroby: většina, např. enterobakterie, stafylokoky, enterokoky •Mikroaerofilní mikroby: lactobacily, kampylobaktery •Kapnofilní: zvýšená tenze C02: meningokoky, gonokoky Generační doba •Délka růstového cyklu, je doba, za kterou se počet bakterií zdvojnásobí •Její délka je individuální vlastností buňky a závisí také na množství živin •Generační doba u Escherichia coli za optimálních podmínek je při 37o C 20min, při 30o C jedna hodina •Generační doba u Mycobacterium tuberculosis je 12 hodin Bakteriální růstový cyklus •Stacionární růstová křivka –Lag-fáze –Logaritmická, exponenciální fáze –Stacionární fáze –Fáze odumírání • •Kontinuální kultivace – udržení populace v logaritmické fázi růst –v průmyslové mikrobiologii –růst bakterií v zažívacím traktu • 250px-Bacterial_growth Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Voda – 80 % živé bakterie, 15% u spor –Nejvíce citlivé na vyschnutí jsou neisserie (gonokok) –Odolnější jsou zástupci kožní flóry –Původce tuberkulózy – vydrží několik týdnů –Vysoce odolné – nokardie, aktinomycety – půdní, plísně, spory, cysty prvoků, vajíčka červů Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Teplota –Minimální, optimální, maximální růstová teplota –Teplotní rozmezí růstu •20-40o C – většina lékařsky významných bakterií –Nejužší teplotní rozmezí má gonokok 30-38,5o C –Schopnost množit se při 0o C mají listerie, yersinie –Schopnost množit se při 8o C mají salmonely, zlaté stafylokoky –Kolem 45o C ještě rostou salmonely, kampylobaktery, Bacillus cereus Podmínky pro kultivaci mikroorganismů •Teplota optimální –0 - 20o C psychrofily – nepatogenní mikroby, žijící ve vodě a půdě –20 - 40o C mesofily – většina mikrobů významných pro lékařskou mikrobiologii –Nad 40o C termofily, horké prameny, kompost, chlévská mrva, nepatogenní, Archaea –Nad 80o C hypertermofily, podmořské sopečné oblasti, Archaea Pěstování bakterií •Tekuté kultivační půdy (Pasteur, Koch) •Kultivace na pevných agarových půdách (Walter Hesse) •1887 Richard Petri zavedl skleněné misky s plochým víčkem – Petriho misky •1914 – první komerčně připravované sušené kultivační půdy Podmínky pěstování bakterií •Dostatek vody, živin, růstových faktorů, optimální teplotu, vhodné složení atmosféry, odpovídající redox potenciál, optimální pH, vhodný osmotický tlak, ochrana před zářením, sterilita prostředí a jeho ochrana před kontaminací •Termostaty – většinou při 37oC, vlhkost, případně se zvýšenou tenzí CO2 •Anaerostaty Druhy kultivačních půd •Tekuté půd –Různé druhy bujónů (masopeptonový bujón, thioglykolátový bujón) •Použití k pomnožení malého množství mikrobů •Zákal, sediment, blanka –Cukrové půdy •Štěpením substrátu dochází ke změně pH roztoku a ke změně barvy přidaného indikátoru Druhy kultivačních půd •Pevné půdy - ztužení původně tekutého základu přidáním 1-2% agaru, (5%) •Výhoda - pěstování mikrobů v izolovaných koloniích •Bakteriální kolonie je společenství buněk vzniklé z původně třeba z jedné životaschopné mikrobiální buňky •Viditelnou kolonii tvoří několik set miliard buněk •Rozočkováním jedné kolonie získáme čistou mikrobiální kulturu • střevní laboratoř Staphylococcus aureus na krevním agaru S Typy půd •Základní – bujón, peptonová voda •Obohacené – krevní agar, čokoládový agar, Bordet-Gengouova půda (Bordetella pertussis, parapertusis), Šulova půda (mykobakteria) •Selektivní – obsahují inhibitor zabraňující růstu nežádoucí flóry, KA s 10% NaCl (stafylokoky), selenitová půda (salmonely), alkalická peptonová voda (vibria), antibiotické disky: bacitracin (hemofily), vankomycin-colistin (meningokoky) Typy půd •Diagnostické půdy – sledujeme, zda mikrob dokáže využít přidaný substrát, –štěpení cukrů, např. glukozy, –Desaminace fenylalaninu (proteus) –Dekarboxylace aminokyselin (lysin, arginin, ornithin) –Štěpení močoviny, redukce nitrátu, –Tvorba H2S, indolu, acetoinu, využití citrátu –Průkaz enzymu - katalása, oxidáza, Pyr-test, ONPG –Chromogenní půdy, kombinované půdy Hajn, –Pestrá řada, komerční soupravy, Typy půd •Selektivně diagnostické – kombinují vlastnosti půd selektivních a diagnostických –Pro gramnegativní mikroby •Endova, MacConkeyho, XLD, SS, CIN, TCŽS –Pro grampozitivní mikroby Claubergova půda (původce záškrtu) •Slanetzův-Bartleyho agar (enterokoky) –Pro anaerobní kultivaci •VL bujón, thioglykolátový, Schaedlerův Escherichia coli na MacConkey agaru P1010104 Černé kolonie vankomycin rezistentního enterokoka na selektivní půdě Enterokok - půda VRE • Chromogenní půda (žlutě roste Proteus sp., červeně Escherichia coli, modře Klebsiella sp.) P1010100 Salmonella sp. rostoucí na Endově půdě (průhledné kolonie) a na XLD (černě) Endo XLD Mikroby a prostředí –Voda, půda, rostliny –Osídlují povrch těla i systémy trávicí, dýchací soustavy vyšších organismů –Lidské střevo je osídleno asi 500 druhy mikroorganismů – cabarna1_big anatomy Obecné podmínky přežívání a usmrcování mikrobů •Nepříznivé faktory zevního prostředí –teplota –UV a ionizační záření –nedostatek vody –nedostatek živin –nevhodné pH prijemne_osvezeni--400x300 •Při pozvolném růstu intenzity nepříznivého faktoru –ustává množení buněk (bakteriostáza) - vratný proces –postupné odumírání buněk, probíhá podle logaritmické křivky - nevratný proces •počet usmrcených buněk závisí –na intenzitě smrtícího činitele –na době jeho působení, expoziční doba •vztah mezi počtem přežívajících a usmrcených buněk je logaritmický •čas potřebný k usmrcení mikrobů závisí –na jejich výchozím počtu, úroveň kontaminace –na druhu mikroorganismu –na ochranném vlivu prostředí (bílkoviny, tuky) –na teplotě – – 250px-Bacterial_growth Konkrétní případy •Neisseria gonorrhoeae – podléhá chladovému šoku byla-li odebrána do chladné transportní půdy •V chladničce při 5o C se mohou množit yersinie, listerie, Escherichia coli, přežívají salmonely a kampylobaktery •většina mikrobů hyne při 60o C - 65o C za 10 – 15 min •spory vydrží 4 – 20 hodin varu Základy epidemiologie přenosných nemocí •Přenos specifického původce nebo jeho toxického produktu z infikovaného jedince na vnímavý objekt •Proces šíření nákazy –Zdroj původce nákazy –Cesta přenosu –Vnímavý jedinec, populace – –Bohumil Ticháček: Základy epidemiologie, vyd. Galén, 1997, str.111-143 o3 Výskyt nákazy •Sporadický – ojedinělá onemocnění bez vzájemné souvislosti •Epidemický – nahromadění v prostoru a čase –explozivní – prudký začátek, několikahodinová inkubační doba, alimentární, respirační onemocnění –kontaktní – vleklý průběh, dlouhá inkubační doba, virová hepatitida A, AIDS •Endemický – bez časového omezení, vychází z přírodních ohnisek nákazy, rezervoárová zvířata •Pandemický výskyt - chřipka Výskyt nákazy •Sporadický – ojedinělá onemocnění bez vzájemné souvislosti •Epidemický – nahromadění v prostoru a čase –explozivní – prudký začátek, několikahodinová inkubační doba, alimentární, respirační onemocnění –kontaktní – vleklý průběh, dlouhá inkubační doba, virová hepatitida A, AIDS •Endemický – bez časového omezení, vychází z přírodních ohnisek nákazy, rezervoárová zvířata •Pandemický výskyt - chřipka Zdroj nákazy •Člověk –nemocný •ke konci inkubační doby, nemocný s typickým nebo atypickým průběhem onemocnění, případně s průběhem abortivním nebo asymptomatickým –zdravý nosič •Zvíře –antropozoonózy (brucelóza, antrax, vzteklina, leptospiróza, toxoplazmóza, tularémie) •Zevní prostředí – kontaminace, spíše cesta přenosu –spóry baktérií, prvoků, vajíčka červů, plísně, nokardie Přenos původce nákazy •přenos přímý –sexuálně přenosné nákazy, pokousání zvířetem, transplacentární •přenos nepřímý –předpokládá schopnost původce přežívat ve vnějším prostředí, na kontaminovaném povrchu, materiálu, nebo v jiném vehikulu Přenos nepřímý •ingescí – alimentární přenos –vodou (salmonely, shigely, cholera, enteroviry, virové hepatitidy, leptospiry, brucely, původci tularémie, amébová dyzentérie, botulotoxin, shigatoxin) –potraviny (VHA, TBC, klíšťová encephalitida, alimentární nákazy) •inhalací – vzdušnou cestou –respirační nákazy –aerosol (Q-horečka, ornithóza, antrax, tularemie) •inokulací – transmisivní nákazy –hmyz (malárie, mor), injekce (VHB) Exogenní infekce •jsou důsledkem styku makroorganismu s virulentním patogenním mikroorganismem •klasické infekce –variola, skvrnitý tyfus, malárie, diftérie, poliomyelitida, pertuse –respirační, průjmová onemocnění, klíšťová encephalitida – – Endogenní infekce • •vznikají zavlečením infekčního agens z kolonizovaného místa (kůže, pochva, ale zejména orofarynx a GIT) do jiného systému téhož organismu. –Primárně endogenní infekce jsou způsobeny potenciálně patogenními mikroorganismy, které jsou normálně přítomny v pacientově mikroflóře. –Sekundárně endogenní infekce jsou způsobeny mikroorganismy, které před vznikem infekce nejprve kolonizovaly sliznice či kůži pacienta Indikace k mikrobiologickému vyšetření •Zjištění etiologického agens •Stanovení citlivosti na antibiotika •Sledování výskytu rezistentních kmenů • •Interpretace mikrobiologického nálezu •Konzultace antibiotické terapie •Spolupráce s pracovníky ústavní hygieny • • Přehled lékařsky významných mikrobiálních agens •G + koky: –Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis –Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae –Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium – •G – koky: –Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis • Přehled lékařsky významných mikrobiálních agens •G+ tyčinky: –Corynebacterium diphteriae, Listeria monocytogenes •G + anaerobní tyčky: –Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum •G – tyčky: •Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter sp., Proteus sp. •G – tyčinky: –Haemophilus influensae • Haemophilus influensae Přehled lékařsky významných mikrobiálních agens •G – nefermentující tyčky – Pseudomonas aeruginosa – Acinetobacter baumanii – Stenotrophomonas maltophilia – Burkholderia cepacia – –