Základy lékařské virologie MUDr. Jana Bednářová, PhD. Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno Klinická mikrobiologie •mikrobiologie = věda o mikrobech üviry a priony - virologie übakterie - bakteriologie ükvasinky a plísně - mykologie üparaziti - parazitologie • •klinická mikrobiologie se zabývá etiologií, patogenezí a imunogenezí onemocnění vyvolaných mikroby Definice viru •lat. virus – „šťáva, jed“, v lékařské terminologii „infekční činitel“ •„Virus je špatná zpráva zabalená do bílkoviny“ (Sir Peter Brian Medawar, nositel Nobelovy ceny za fyziologii a lékařství v roce 1960) •„Viry můžeme s trochou nadsázky definovat jako Tolkienovy Nazguly, bytosti ani živé, ani mrtvé, pohybující se v zemi nikoho, na frontě mezi životem a neživotem.“ (Marek Orko Vácha, Tančící skály, 2003) P.B.Medawar – britský biolog Marek Vácha – kněz, teolog, přírodovědec, pedagog a spisovatel Povaha virů •viry jsou nebuněčné částice tvořené nukleovou kyselinou (DNA nebo RNA) a bílkovinou, množící se jen v živých hostitelských buňkách • •viry nejsou organizovány jako buňky, ale jako částice •obsahují jediný typ nukleové kyseliny: buď RNA nebo DNA •nemnoží se dělením, ale syntézou svých složek •syntéza je závislá na ribosomech hostitelské buňky Viry jako mikroorganismy •nejsou viditelné běžným mikroskopem •nerostou na kultivačních půdách •nejsou citlivé na antibiotika • •šíří se v populaci •vyvolávají onemocnění •spouští imunitní reakci •diagnostikují se metodami přímého a nepřímého průkazu Historie virologie •starověké civilizace - první popisy onemocnění virového původu, viry jako původci nebyly známy, studovány pouze projevy onemocnění (pravé neštovice, přenosná dětská obrna, vzteklina…) glyph Memphis, Egypt, 1400 př.n.l. 1892: objev infekční virové částice •virus mozaikové choroby tabáku •Dimitrij Ivanovskij (1864 – 1920) •dokázal, že šťáva z listů nakažených mozaikovou chorobou tabáku zůstává infekční i po filtraci přes porcelánový bakteriologický filtr •domníval se, že jde o bakteriální toxin, který označil termínem „virus“ • mosaic Mozaiková choroba tabáku První živočišný virus •virus slintavky a kulhavky •1898: Friedrich Löffer a Paul Frosch provedli první pokusný přenos živočišného viru •filtrovali tekutinu vzniklou rozmělněním sliznice infikovaných zvířat •filtrát vyvolal infekci u dalších zvířat – potvrzení mikroorganismu menšího než bakterie jako původce onemocnění • C:\Users\27958\Desktop\slintavka.png Virus slintavky a kulhavky První lidský virus •virus žluté zimnice •velké epidemie v 17. – 19. století v Africe, Jižní a Střední Americe •1881: Carlos Finlay popsal přenos žluté zimnice komárem Aedes aegypti •1902: Walter Reed objevil virus žluté zimnice a potvrdil přenos komárem C:\Users\27958\Desktop\Walter-Reed.jpg C:\Users\27958\Desktop\carlos_finlay.jpg Carlos Finlay Walter Reed Carlos Finlay – kubánský lékař, epidemiolog Walter Reed – americký lékař 40. léta 20. století – mohutný rozvoj virologie Stavba virů •virion = virová částice -vnitřní část – dřeň neboli nukleoid obsahuje nukleovou kyselinu -zevní část – kapsida obsahuje bílkovinu • • nukleoid + kapsida = nukleokapsida (neobalené viry, např. pikornaviry, adenoviry) • • nukleokapsida může být uložena ve virovém obalu (obalené viry, např. herpesviry) C:\Users\27958\Desktop\virion.png Nukleová kyselina •typ a organizace virového genomu: –RNA nebo DNA –jednovláknová nebo dvouvláknová –segmentovaná nebo nesegmentovaná –lineární nebo kruhová –pseudodiploidní genom (retroviry – dvě shodná pozitivní vlákna RNA) Kapsida •sestavena z bílkovinných podjednotek neboli protomer uspořádaných symetricky -kapsida s kubickou (ikosaedrální) symetrií – tvar dvacetistěnu (např. herpesviry, adenoviry) -kapsida se spirální (helikální) symetrií – tvar válce (např. orthomyxoviry) -kapsida s komplexní symetrií – např. bičíkaté fágy, poxviry AOMCHCAMBU042CA4FBZKKCAQ0B54ACAAOL4GOCAJCU2FUCACJZ95UCABD6KQBCAXLNUWCCAX3MU8CCAMZP1B9CAMYKAVKCAPBOA SACAHUH9KNCAXQ2ONFCAEP67M8CAL6BYVXCAYVRDH4CADL1H5PCAOKDNLX f11 SU13DCAOFL3C7CAY5N50OCABEBAS6CAFAEA35CASLXH9PCA8AP0ZKCAM04BE1CA1FKLTICAQ1YSN9CAKJKDKQCA4NMIYNCA2H38 BICAHURMTUCAHNVDTRCA12PMHJCAYFFY10CAM3ABBPCAU23Y0XCA7BMOFK UDS4BCA7Z4ESZCAQ6U27MCAWYVI04CAGJX74HCASUP013CAMS0CJLCAOQG64ACA0VSXKKCA4WARS4CATMC32OCAZKQXQ1CAWI85 CCCA1BK2U2CA6B2LN0CA7N4H2TCAYLD2O2CAJUUSIPCA1NCKCOCA731KC7 VIOSGCAT9F9LOCAYIZU0JCAW1NRD6CAU2BY3PCASY3W5NCA2CONE6CA3G4RRZCACB42RNCAQXSL4UCAW3IDX2CAF67WNVCA2Y5J CQCAND9YP9CAGY3JD3CAY7CH5VCAXJ8FM9CARX6J3PCA7EKBMCCA2KVMW6 WETLTCAS5Z1P0CAUD56NDCABC28VVCADR4F9DCAASXIFYCA3HECG2CAHHPXCLCA949EF0CAGHRWERCA05OU6HCAFN3EXFCAFLOF 4DCAV3RMJJCAR6UKOGCABLBY6ACA5WAQP3CAZY7NPICACYZAF1CAL9NVVY Komplexní symetrie Kubická (ikosaedrální) symetrie Spirální (helikální) symetrie Třídění virů a)dle povahy hostitele: viry bakterií (bakteriofágy), kvasinek, prvoků, rostlin, hmyzu, obratlovců b)dle přítomnosti obalu: neobalené viry, obalené viry c)dle charakteru genomu: RNA viry, DNA viry d)dle symetrie kapsidy: viry s ikosaedrální symetrií, helikální symetrií, komplexní symetrií Názvosloví virů •viry nemají oficiální latinské dvoujmenné názvy •virové čeledi – název končí koncovkou -viridae •virové podčeledi – koncovka -virinae •virové rody – koncovka –virus •virový druh není jednoznačně definován, používají se vžité názvy •příklad: čeleď Herpesviridae, podčeleď Alphaherpesvirinae, rod Simplexvirus, druh lidský herpesvirus 1 Virové infekce •hepatitidy: HAV, HBV, HCV, HDV, HEV •herpetické viry: HSV, VZV, CMV, EBV, HHV6… •neuroviry: virus klíšťové encefalitidy, enteroviry, virus vztekliny… •respirační viry: viry chřipky, adenoviry, rhinoviry, koronaviry… •virové gastroenteritidy: rotaviry, kaliciviry, astroviry… •virus příušnic, zarděněk, spalniček, HIV, aj. Velikost virů: 20 nm (pikornaviry) – 300 nm (poxviry) Virologické vyšetřovací metody • a) přímý průkaz • b) nepřímý průkaz (průkaz serologický) D:\dia_hub_hpv_new_1280px.jpg Přímý průkaz virů •ve vyšetřovaném vzorku lze prokazovat: • ümorfologicky typické částice (elektronová mikroskopie) üantigeny (serologické metody) üvirové nukleové kyseliny (molekulárně biologické metody) üinfekční agens (izolace viru na vhodných objektech) Mikroskopický průkaz virů •elektronová mikroskopie •1933: sestrojen elektronový mikroskop na Vysoké škole technické v Berlíně •1939: první elektronoptické snímky viru mozaikové choroby tabáku •technika negativního kontrastu 1168f03 Elektronoptický snímek viru mozaikové choroby tabáku Poxviry – jediné pozorovatelné v běžném elektronovém mikroskopu Průkaz virových antigenů •imunoenzymatické metody – ELISA, např. průkaz HBsAg, HBeAg •přímá imunofluorescence – fluorescenční mikroskopie, např. průkaz antigenů respiračních virů •latexová aglutinace – např. průkaz rotavirových a adenovirových antigenů ve stolici C:\Users\27958\Desktop\Plasmatec_Products_Latex-serology-tests-img.png P2080015 Imunofluorescence – jedna složka značena fluorescenčním barvivem, průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu Průkaz virových nukleových kyselin •polymerázová řetězová reakce •přímý průkaz NK virů (RNA nebo DNA) •různé modifikace •výhody: vysoká specificita, rychlost, možnost detekce více agens současně (multiplexní PCR) •nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace • Výstupy vyšetření real-time PCR • •Jednotlivá vyšetření – •Multiplex • • • • PCR – příklady termocyclerů C:\Users\27958\Desktop\big-rotorgene.jpg C:\Users\27958\Desktop\smart-cycler-system.jpg Princip PCR •opakované cykly tří jednoduchých reakcí: –denaturace dvojšroubovice hledané DNA na dvě izolovaná vlákna (94 °C) –annealing - připojení dvou krátkých syntetických nukleotidů (primery) na tato vlákna (54 – 65 °C) –prodlužování primerů v přítomnosti vhodných reakčních složek a enzymu Taq-polymerasy za vzniku dvou kopií hledané DNA (72 °C) pcranimatie Izolace viru •průkaz infekčního agens na vhodných objektech: üpokusná zvířata – bílá myš ükuřecí zárodky – očkování viru do amnia, alantois, na chorioalantoidní membránu, do žloutkového vaku ütkáňové (buněčné) kultury – primární kultury opičích ledvin, buněčné linie buněk HeLa, Hep-2, Vero, diploidní kmeny z buněk emryonálních plic C:\Users\27958\Desktop\Myš.jpg C:\Users\27958\Desktop\19-0.jpg C:\Users\27958\Desktop\a_bunecne-kultury.png Nepřímý průkaz virů •= průkaz specifických protilátek neboli průkaz serologický • •serologické reakce – reakce mezi antigeny a protilátkami in vitro •použití v diagnostice virových infekcí a některých bakteriálních infekcí (obtížně kultivovatelné bakterie) •materiál: 5 - 7 ml srážlivé krve, likvor, synoviální tekutina Protilátky •imunoglobuliny schopné specificky se vázat na antigen •tvořeny plazmatickými buňkami (vznik aktivací B lymfocytů) •třídy imunoglobulinů: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE imunoglobuliny_01 Dynamika tvorby protilátek •IgM – první protilátky, přetrvávají týden až několik měsíců, svědčí pro čerstvou infekci •IgA – přetrvávají o něco déle, svědčí pro čerstvou nebo nedávnou infekci •IgG – nejvyšší hladina měsíc po začátku onemocnění, mohou přetrvávat roky Výsledek obrázku pro dynamika jednotlivých tříd protilátek Přehled serologických metod 1.Precipitace 2.Aglutinace 3.Komplement fixační reakce (KFR) 4.Reakce se značenými složkami: – - imunofluorescence – - enzymová imunoanalýza – - Western blot (imunoblot) • • Precipitace •antigen koloidní povahy •precipitační neboli vločkovací testy na lues •VDRL, RRR, RPR • • kardiolipin + protilátky v séru precipitace P5280008 Aglutinace •antigen korpuskulární povahy •antigen + hledaná protilátka viditelný shluk (aglutinát) •průkaz protilátek např. u salmonelózy, yersiniózy, listeriózy, tularémie P2080013 Komplement fixační reakce • •komplex antigen + hledaná protilátka •komplement •indikátorový neboli hemolytický systém (beraní erytrocyty senzibilizované králičí protilátkou) ü ü •zábrana hemolýzy hemolýza •pozitivní reakce negativní reakce C:\Documents and Settings\op\Plocha\petra\přednášky\foto lab\clip_image002.jpg Imunofluorescence •jedna složka značena fluorescenčním barvivem, průkaz pomocí fluorescenčního mikroskopu •přímá – průkaz antigenu •nepřímá – průkaz protilátek • Nepřímá imunofluorescence - protilátky proti HHV6 Výsledek obrázku pro imunofluorescence hhv6 Enzymová imunoanalýza •jedna složka značena enzymem, který rozloží přidaný substrát za vzniku barevného produktu •výsledek: barevná reakce •hodnocení: měření absorbance •ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) Výsledek obrázku pro ELISA Univerzální použití při stanovení protilátek proti virům Western blot •antigen rozdělený na jednotlivé polypeptidy dle molekulové hmotnosti na nitrocelulózovém pásku •vazba hledaných protilátek ze séra na příslušné antigenní frakce •výsledná reakce – barevný proužek • WB02 Automatizace serologických vyšetření •analyzátory na principu chemiluminiscenční nebo elektrochemiluminiscenční imunoanalýzy •výhody: •rychlost vyšetření •klinická senzitivita, specificita •možnost předřazení vzorků (statimová vyšetření) •široké menu (více metod současně) •minimalizace hand-on-time •použití čárových kódů •import/export do LIS Cobas e411, Roche Priony •z angl. proteinaceous infectious particles •neobsahují nukleovou kyselinu •vysoká odolnost k zevním vlivům •účinná kombinace autoklávování 134 °C/1 hod. a působení 1 M NaOH • •Stanley Prusiner (1997 Nobelova cena) C:\Users\27958\Desktop\prusiner-award-2948-content-portrait-mobile.jpg Vlastnosti prionů •konformační změna alfa-helikální struktury prionového proteinu na patologickou beta strukturu I11-08-prion Prionové choroby •velmi dlouhá inkubační doba (několik let) •chronický, postupně se zhoršující průběh s fatálním koncem •minimální nebo neobvyklé patologické změny •vliv genetických faktorů •neúčast imunitního systému Prionové choroby •= přenosné spongiformní encefalopatie • •scrapie u ovcí a koz •bovinní spongiformní encefalopatie (BSE, „nemoc šílených krav“) u krav • •kuru •Creutzfeldt-Jakobova choroba prion2 prion3 prion4 Scrapie, Anglie, 1759 BSE, UK a Portugalsko, 1985 Kuru, Nová Guinea, 1957