VYŠETŘENÍ DÁRCŮ KRVE Mgr. Jana Tylečková VYŠETŘENÍ ODEBRANÉ KRVE A JEJÍCH SLOŽEK  Vyhláška o lidské krvi 143/2008 ve znění pozdějších předpisů  Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP  Vzorek na vyšetření se obvykle získává v souvislosti s vlastním odběrem  V odebrané krvi a jejích složkách se vyšetřují:  Markery nejvýznamnějších infekčních chorob přenosných krví  Základní imunohematologické parametry SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ  Serologická vyšetření (povinná):  Anti-HCV  HBsAg  Anti-HIV 1,2  Antigen p24 (HIV)  Vyšetření protilátek proti syfilis  Nepovinná serologická vyšetření:  Kombinovaný test HCV Ag/Ab (provádí cca 1/3 zařízení v ČR)  Anti-HBc SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ SEROLOGICKÉ METODY  Serologické metody - průkaz přítomnosti infekčního agens v krvi dárce je založen na průkazu specifických protilátek (nepřímý průkaz) nebo antigenů (přímý průkaz)  Imunochemické metody - založeny na reakci antigenních determinant s vazebným místem protilátky.  U imunochemických metod je dosahováno zvýšení citlivosti značením jedné z reagujících složek – antigenu nebo protilátky látkou, která je v závěru reakce detekována.  Na TTO nyní používány metody chemiluminiscence a elektrochemiluminiscence OMEZENÍ SÉROLOGICKÝCH METOD  Všechny screeningové laboratorní testy jsou zatíženy rizikem diagnostického okna  Diagnostické okno sérologických testů:  HIV – 2 až 3 týdny  HBV – 4 až 6 týdnů  HCV – 2 až 6 měsíců  Důraz na vysokou senzitivitu požívaných testů  metody NAT (Nucleic Acid Testing) SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ - PCR  Přímý průkaz infekčního agens v krvi dárce je založen na detekci nukleových kyselin infekčního agens (NAT)  Detekce nukleových kyselin  V současné době nabývá na významu především metoda real-time PCR a multiplexní PCR.  Tato moderní technologie umožňuje rychlou a citlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA nebo RNA infekčního agens.  MULTIPLEXNÍ PCR  Současná amplifikace několika cílů najednou (DNA, RNA)  Použito je více párů specifických primerů komplementárních k různým cílovým sekvencím v jedné amplifikační reakci  Reverzní transkripce a PCR amplifikace probíhá v téže reakční směsi  REAL-TIME PCR  Reakční směs je obohacena o detekční sondy značené oznamovacími fluorescenčními barvivy, tyto sondy během PCR hybridizují se vznikajícími produkty  Detekce a rozlišení PCR produktů v reálném čase jsou prováděny měřením fluorescence uvolněných oznamovacích barviv PCR  Polymerázová řetězová reakce – metoda, která slouží k namnožení úseků DNA, výsledkem je obrovské množství kopií původní sekvence DNA  Tři základní pochody PCR, které se cyklicky opakují:  1. DENATURACE – denaturace DNA vlivem vysoké teploty (92 – 96°C), rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA, rozvolnění dvoušroubovice, vznik jednovláknové DNA  2. HYBRIDIZACE – nasednutí krátkých úseků DNA (primery – 20 až 25 nukleotidů) při teplotě 45 – 65°C  3. ELONGACE – na řetězec DNA je napojena DNApolymeráza, která zajišťuje připojování nových nukleotidů (syntéza DNA) SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ - PCR  Vyšetření nukleových kyselin (NAT) – v ČR nepovinné (v zemích Z Evropy se provádí):  HIV-RNA  HCV-RNA  HBV-DNA  Dle epidemiolog. situace:  WNV - RNA (sezonně)  HTLV I/II - RNA (zámoří) VÝZNAM NAT  Zkrácení diagnostického okna  Je důležité, abychom byli schopni identifikovat dárce, kteří se nacházejí ve velmi časných fázích infekce HCV, HIV nebo HBV. Toto kritické období před vytvořením protilátek proti viru je označováno jako „imunologické okno“.  U HIV a HCV vzniká již během „imunologického okna“ vysoká virémie, kdy pravděpodobnost přenosu nákazy je vysoká.  Naopak během infekce HBV je rychlost replikace virů v období imunologického okna nízká.  HIV o 7 – 9 dní  HCV o 59 – 65 dnů  HBV o 25 – 30 dnů SCREENING INFEKČNÍCH MARKERŮ SEROLOGICKÉ METODY – POVINNÉ TESTY  Anti-HCV  HBsAg  Anti-HIV 1,2  Antigen p24 (HIV)  Vyšetření protilátek proti syfilis  V případě reaktivity se vzorek vyšetřuje v dubletu, při opakované reaktivitě se vzorek zasílá ke konfirmaci do NRL (povinnost), TP nejsou uvolněny k použití. IMUNOHEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ DÁRCŮ KRVE A JEJÍCH SLOŽEK  Závazná vyšetření dle legislativy:  Z každého odběru se provádí:  vyšetření krevní skupiny AB0, RhD  screening nepravidelných protilátek proti erytrocytům  U každého dárce se stanoví Rh fenotyp (C, c, E, e) a antigen Kell. V případě nálezu Kell pozitivity se vyšetřuje i antigen Cellano. STANOVENÍ AB0  Noví dárci:  Vyš. 2x ze 2 nezávislých vzorků (Za nezávislé vzorky lze považovat např. krevní vzorek odebraný před odběrem pro vyšetření krevního obrazu a/nebo krevní vzorek odebraný při vlastním odběru např. z přídatného váčku odběrové soupravy a/nebo segment hadičky spojené s transfuzní soupravou / transfuzním přípravkem. )  Z toho alespoň 1x stanovení antigenů erytrocytů i stanovení protilátek proti nim  Minimálně: diagnostická séra anti-A a anti-B, diagnostické erytrocyty A1 a B. Druhé vyšetření AB0 může zahrnovat pouze určení antigenů.  Opakovaní dárci:  Vyšetřují se alespoň antigeny erytrocytů (1x)  Za druhé (referenční) vyšetření se považuje výsledek vyšetření v databázi z předchozích odběrů. Je nutné zajištění kontroly shody výsledku vyšetření krevní skupiny s údaji v databázi. STANOVENÍ RHD ANTIGENU  Noví dárci:  2 vyšetření, ze dvou nezávislých vzorků  Diagnostická séra: anti-D třídy IgM s 2 různými klony + kontrola falešné pozitivity („Rh kontrola“)  slabé D:  vyšetřuje se u RhD negativních dárců ze 2 nezávislých vzorků  Diagnostická séra anti-D s 2 různými klony (IgG), metodou NAT + kontrola falešné pozitivity („Rh kontrola“). Diagnostická séra by měla zachytávat minimálně variantu DVI.  V případě pozitivního či diskrepantního výsledku s oběma diagnostickými séry pro vyšetření slabého D se dárce označí jako Dw/v, transfuzní přípravek jako RhD pozitivní; při jasné negativitě s oběma séry se dárce i transfuzní přípravek označí jako RhD negativní.  Opakovaní dárci:  1 vyšetření, diagnostické sérum anti-D třídy IgM + kontrola falešné pozitivity („Rh kontrola“)  Za 2. (referenční) vyšetření se považuje výsledek vyšetření v databázi z předchozích odběrů  Neprovádí se vyšetření slabého D STANOVENÍ RH FENOTYPU A ANTIGENU KELL  Vyš. antigenů C, c, E, e , Cw (dop.) a K (Kell)  U nového dárce 1x + 1x se ještě ověřuje z druhého nezávislého vzorku nebo při následujícím odběru  Nevyžadují se 2 různé klony diagnostických sér  V případě nálezu Kell pozitivity (K+) se vyšetřuje i antigen Cellano (k). Další antigenní systémy:  především u dárců krevní skupiny 0 je vhodné určit fenotyp i v dalších antigenních systémech (např. Duffy, Kidd, Lutheran, MNSs, aj.) SCREENING NEPRAVIDELNÝCH PROTILÁTEK PROTI ERYTROCYTŮM  U každého odběru se provádí vyšetření přítomnosti nepravidelných protilátek přiměřeně citlivou metodou se zaměřením na záchyt klinicky významných protilátek, především anti-D.  Metoda: NAT (nepřímý antiglobulinový test)  Diagnostické erytrocyty: k vyšetření se mohou použít diagnostické erytrocyty ve směsi. Identifikace nepravidelných protilátek proti erytrocytům:  V případě pozitivního výsledku screeningového vyšetření nepravidelných protilátek proti erytrocytům je vhodné provést identifikaci protilátky(-ek).  Použití transfuzního přípravku erytrocytů v případě zjištění nepravidelných protilátek proti erytrocytům záleží na klinickém významu zjištěné protilátky