Exprese genů a replikace DNA
seminář
Kateřina Vopěnková
vopenkova@med.muni.cz
Exprese genů
Co dává proteinu jeho funkci?
• prostorové uspořádání jeho molekuly – tvar,
a fyzikální a chemické interakce, kterých je schopný
Mutantní kanál CFTR
netransportuje chloridové
ionty, což vede k vytvoření
hustého hlenu v okolí buněk
Normální kanál CFTR
transportuje chloridové
ionty ven z buněk
Co dává proteinu jeho tvar a schopnost jeho
interakcí?
• sekvence aminokyselin daného proteinu
správně složená
sekvence aminokyselin
nesprávně složený peptid
v důsledku zařazení
nesprávné aminokyseliny
Mutace
Mutace pouze zaměňující jednu aminokyselinu
mohou a nemusí mít vliv na funkci proteinu, záleží:
jak moc se změní výsledné uspořádání a tvar proteinu,
v případě enzymu také jeho vazebná místa
Způsobí substituční mutace (náhrada nukleotidu jiným)
onemocnění?
Záměna 1 nukleotidu v genu pro hemoglobin
způsobí záměnu 1 aminokyseliny, což změní
strukturu i chování výsledného hemoglobinu
a způsobí srpkovitou anémii
Záměna neovlivňující tvar a vazebné
vlastnosti proteinu – zdravý fenotyp
Substituční mutace
• nukleotid v DNA je nahrazen jiným
původní sekvence genu substituce jednoho nukleotidu
Mutace způsobující vyštěpení (deleci) nukleotidu
z genu, nebo vložení (inzerci) nového nukleotidu:
02:30
Nehlasovalo:100
(100,0%)
A. způsobují posun čtecího rámce (zařazení
jiných aminokyselin do výsledného proteinu)
B. vedou k nahrazení jedné aminokyselinu za
jinou ve výsledném proteinu
C. mohou způsobit objevení nového stop
kodonu v sekvenci DNA
D. mohou způsobit syntézu úplně změněného
proteinu, který je nefunkční
E. nemají na výsledný protein žádný vliv
Mutace způsobující vyštěpení (deleci) nukleotidu
z genu, nebo vložení (inzerci) nového nukleotidu:
02:30
Nehlasovalo:100
(100,0%)
A. způsobují posun čtecího rámce (zařazení
jiných aminokyselin do výsledného proteinu)
B. vedou k nahrazení jedné aminokyselinu za
jinou ve výsledném proteinu
C. mohou způsobit objevení nového stop
kodonu v sekvenci DNA
D. mohou způsobit syntézu úplně změněného
proteinu, který je nefunkční
E. nemají na výsledný protein žádný vliv
příklad delece jednoho nukleotidu
příklad inzerce jednoho nukleotidu
původní sekvence genu
Mutace s posunem čtecího rámce
Mutace způsobující inzerce nebo delece jednoho a více nukleotidů (kromě
násobků tří) mění čtecí rámec – při syntéze proteinů na ribozomech jsou pak
nukleotidy mRNA rozpoznávány v jiných trojicích
Posunové mutace obvykle vedou k tvorbě nefunkčních proteinů
Příklad mutace s posunem čtecího rámce
TAY–SACHSOVA CHOROBA
• vzácné autozomálně recesivní genetické
onemocnění
• mutovaný HEXA gen
(až u 80 % pacientů – inzerce 4 bp)
• tělo neprodukuje funkční lyzozomální
hydrolytický enzym hexosaminidázu A
(Hex-A)
• bez tohoto enzymu nejsou metabolizovány
některé membránové glykolipidy
(gangliosidy) a hromadí se v mozku a
neuronech → smrt nervových buněk
• svalová slabost, ztráta zraku anebo sluchu,
křeče, ztráta hybnosti (upoutání na vozík)
Society for Neuroscience - Treating Tay-Sachs Disease." Society for Neuroscience
Mutace v sekvenci intronů
Mutace v sekvenci intronů (úseky vystřižené z RNA po transkripci) nemění
funkci výsledného proteinu nebo RNA, pokud ovšem nezmění sestřih tvořené
RNA (to, které úseky jsou rozpoznávané jako introny a vystřihovány)
promotor/
regulační
sekvence
exon 2
intron 1 intron 2exon 1
5'UTR 3'UTR
exon 3
5'UTR a 3'UTR =
nepřekládané oblasti
(untranslated regions)
na 5' a 3' konci mRNA
gen
Transkripce
primární
transkript
RNA
exon 1
5'UTR 3'UTR
exon 3exon 2
místo
štěpení
intron 1 intron 2
degradace degradace
zralá RNA
Sestřih RNA
Příklady genů s alternativním sestřihem mRNA
• gen BCR pro receptor B-lymfocytů a zároveň pro protilátky (imunoglobuliny)
– jedním typem sestřihu vzniká protein vázaný na plazmatickou membránu
(receptor B-lymfocytů, díky kterému rozpoznávají antigeny), jiným typem
sestřihu vzniká volný, sekretovaný protein – protilátka daného B-lymfocytu po
rozpoznání antigenu (versus VDJC rekombinace – editace genomu)
• gen CDKN2A (také INK4A, ARF) pro inhibitory cyklin-dependentních kináz
podílejících se na regulaci buněčného cyklu v kontrolním bodě G1/S
– jedním typem sestřihu vzniká inhibitor CDK p16 (regulace hladiny proteinu Rb),
jiným typem sestřihu vzniká inhibitor CDK p14 (regulace hladiny proteinu mdm2/p53)
• gen Bcl-x pro transmembránový protein mitochondrií podílející se na regulaci
apoptózy – jedním typem sestřihu vzniká negativní regulátor apoptózy Bcl-xL
(podporuje přežití buněk), jiným typem sestřihu vzniká kratší varianta Bcl-xS,
která působí jako pozitivní regulátor apoptózy (podporuje buněčnou smrt)
• gen Fas (také CD95) pro „receptor smrti“ podílející se na regulaci vnější dráhy
apoptózy – jedním typem sestřihu vzniká protein vázaný na plazmatickou
membránu a působící jako receptor smrti (podporuje apoptózu), jiným typem
sestřihu vzniká volný, sekretovaný protein, který inhibuje apoptózu
• mutace v místech sestřihu vedou k syntéze mnohem delšího nebo kratšího
proteinu → změna tvaru, ztráta funkce
• všechna geneticky podmíněná onemocnění (způsobená mutacemi v DNA)
mohou být způsobena jak mutacemi v kódujících oblastech genů, tak v
místech sestřihu
Sestřihem RNA se odebírají introny z pre-mRNA
spliceozom
vystřižený intron
ponechaný exon
Mutace, které způsobí nefunkčnost proteinu, ovlivňují funkčnost
nebo chování buněk nezávisle na tom, jakým způsobem výsledný
protein svou funkci ztratil
Více o geneticky podmíněných onemocněních v přednáškách č. 10 a 11 – Genetika
- pacienti se stejným geneticky podmíněným onemocněním
mají často úplně odlišné mutace ve stejném genu
(případně v různých genech, jejichž proteiny ovlivňují stejnou
funkci, stejnou metabolickou dráhu, stejnou signální dráhu...)
- může se ale lišit závažnost symptomů (nefunkční enzym versus
snížená funkce versus změna lokalizace v buňce, atd.)
Mutace ani v homozygotním stavu (aspoň v daných podmínkách) nevede ke
smrti pacienta – výhodná obvykle v homozygotním stavu
obě alely genu kódují
nefunkční protein
heterozygot
A / A A / a a / a
obě alely genu kódují
funkční protein
Evoluční výhodnost některých mutací
– v homozygotním stavu
Lidé nesoucí deleci 32-bp v genu kódujícím
CCR5 jsou rezistentní k infekci HIV-1
http://www.delta-32.com/research.html
Evoluční výhodnost některých mutací
– v heterozygotním stavu
V některých případech špatně tvarovaný protein chrání jedince před parazity
využívajícími tento protein ke vstupu do těla nebo buněk hostitele, ke své
reprodukci, nebo zabraňuje propuknutí smrtelných symptomů onemocnění
Obvykle nejvýhodnější pro heterozygoty (jedna kopie genu produkuje funkční
protein, ale druhá alela ne) – jsou částečně chránění, a neumírají na dané
genetické onemocnění spojené s úplnou nefunkčností daného proteinu v těle
obě alely genu kódují nefunkční protein
– pokud je to neslučitelné se životem,
pacient umírá
heterozygot
A / A A / a a / a
obě alely genu kódují
funkční protein
Snížená pravděpodobnost úmrtí na malárii
Heterozygoti pro mutaci v genu pro hemoglobin β (která u homozygotů
způsobuje srpkovitou anémii) jsou relativně chráněni proti malárii
www.nature.com
Změna tvaru erytrocytů ve stresových
podmínkách (hypoxie, acidóza...)
Aa (AS)
heterozygoti s jednou alelou pro abnormální hemoglobin β
Vlivem přítomnosti parazitů (stresový
faktor) dojde ke změně tvaru erytrocytů
– srpkovité erytrocyty s parazity jsou
odbourávány přednostně – selektivní
fagocytóza, a odbourávání ve slezině
Parazitický prvok (Plasmodium) se
pomnoží v jaterních buňkách a pak
v červených krvinkách, šíří se v těle,
způsobuje odumírání jaterních
buněk a erytrocytů, a způsobuje
symptomy malárie
AA
homozygoti s normálním hemoglobinem β
Snížená pravděpodobnost úmrtí na choleru
• cholera toxin A modifikuje G-protein, který tak zůstává stále aktivní, což způsobuje
mimo jiné nadměrnou aktivaci jednoho z iontových kanálů – CFTR (cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator)
- Cl- a další ionty jsou pumpovány ze střevních buněk do dutiny střeva, což vede ke
ztrátám vody ze střevních buněk do střev a těžkému průjmu
Když je iontový kanál CFTR mutovaný a nefunkční, nemůže být nadměrně aktivovaný
→ heterozygoti pro tuto mutaci mají nižší pravděpodobnost, že zemřou na choleru
PKA
Více o příslušné signalizaci v přednášce č. 5 – Buněčná signalizace
Replikace DNA
Replikace lidské chromozomální DNA:
04:00
Nehlasovalo:100
(100,0%)
A. probíhá pouze po zachycení růstových
faktorů příslušnými receptory
B. je v buňce nezbytná pro vznik proteinů
C. probíhá ve všech buněčných typech
dospělého člověka zhruba stejně často
D. probíhá pouze v buňkách připravujících
se na dělení
E. probíhá v rostoucích a regenerujících
tkáních
F. probíhá před každou transkripcí
Replikace lidské chromozomální DNA:
04:00
Nehlasovalo:100
(100,0%)
A. probíhá pouze po zachycení růstových
faktorů příslušnými receptory
B. je v buňce nezbytná pro vznik proteinů
C. probíhá ve všech buněčných typech
dospělého člověka zhruba stejně často
D. probíhá pouze v buňkách připravujících
se na dělení
E. probíhá v rostoucích a regenerujících
tkáních
F. probíhá před každou transkripcí
• vede ke vzniku identické sesterské chromatidy každého chromozomu
Replikace DNA probíhá pouze před dělením buňky
https://is.muni.cz/auth/do/med/el/anim/pages/06-04-replikace-dna.html
Jak můžeme blokovat replikaci DNA:
04:00
Nehlasovalo:100
(100,0%)
A. Záměnou nukleotidů v obou
řetězcích – mutovaný dvouřetězec
DNA se nereplikuje
B. Inhibitory topoizomeráz (enzymů
odstraňujících z DNA
nadšroubovicové vinutí)
C. Inhibitory DNA-polymerázy
D. Zapojením nukleotidu bez reaktivní
OH skupiny na 3-uhlíku
E. Zapojením modifikovaného
nukleotidu bez cukerné složky
Jak můžeme blokovat replikaci DNA:
04:00
Nehlasovalo:100
(100,0%)
A. Záměnou nukleotidů v obou
řetězcích – mutovaný dvouřetězec
DNA se nereplikuje
B. Inhibitory topoizomeráz (enzymů
odstraňujících z DNA
nadšroubovicové vinutí)
C. Inhibitory DNA-polymerázy
D. Zapojením nukleotidu bez reaktivní
OH skupiny na 3-uhlíku
E. Zapojením modifikovaného
nukleotidu bez cukerné složky
Topoizomerázy jsou enzymy, které odstraňují nadměrné
svinutí DNA způsobené aktivitou helikáz
- štěpí jeden řetězec DNA (topoizomeráza I) nebo oba (topoizomeráza II)
a poté rozštěpený řetězec opět spojí
Relaxovaná dvoušroubovice DNA
Dvoušroubovice DNA nadměrně svinutá
na jedné straně kvůli rozvíjení na druhé
aktivita helikázy
helikáza
nadšroubovicové
vinutí („supercoiling“)
Topoizomeráza II – dvouřetězcový zlom a znovuspojení
Topoizomeráza I – jednořetězcový zlom a znovuspojení
Inhibitory topoizomeráz
- indukované poškození DNA buněk při replikaci
Inhibují například znovuspojení DNA při aktivitě topoizomerázy II
→ dvouřetězcové zlomy vznikající dočasně v DNA dělících se buněk vlivem
aktivity topoizomerázy II nejsou odstraněny a zůstávají
Poškození DNA je opravitelné,
buňka zahájí opravy DNA a přežije
Poškození DNA je neopravitelné,
nebo je oprava inhibovaná dalšími léčivy,
eukaryotická buňka odumírá apoptózou
normálně je zlom znovu spojený
zlom není znovu spojený
Topoizomeráza II vytvoří přechodné
dvouřetězcové zlomy v DNA
inhibitory topoizomeráz
Inhibitory topoizomeráz v léčbě nádorů
– indukované poškození DNA buněk při replikaci
Antracykliny (například doxorubicin) a některá další protinádorová léčiva
inhibují znovuspojení DNA při aktivitě topoizomerázy II → zůstávají
dvouřetězcové zlomy, které mají v DNA dělících se buněk vznikat pouze
dočasně
Inhibitory topoizomeráz: Fluorochinolony interferují s
aktivitou bakteriální topoizomerázy
Použití fluorochinolonů:
oční infekce, infekce respiračního traktu,
vdechnutí antraxu, mykobakterie (TBC),
infekce kloubů a měkkých tkání,
infekce trávicího traktu a břicha,
bakteriální zánět prostaty, chlamydie
Vedlejší účinky:
natržení šlach, poškození vývoje šlach a
kostí u plodu při podání těhotným
ženám, změny EKG, zmatení, závratě,
křeče a mnoho dalších
Používané pouze u pacientů, kteří nemají jinou možnost léčby
– riziko vážných vedlejších účinků
Inhibitory prokaryotických DNA-polymeráz
Jedna ze skupin antibiotik jsou inhibitory prokaryotických DNA-polymeráz
– brání replikaci DNA a tím i dělení (množení) bakteriálních buněk
Dvoušroubovice DNA
5' konec 3' konec
3' konec
5' konecNové vlákno DNA při replikaci (a RNA při transkripci)
vždy přibývá připojováním nových nukleotidů na 3’ konci
nově připojovaný nukleotid
(nukleotid trifosfát, u kterého
dojde k odštěpení dvou fosfátů)
Nové nukleotidy DNA i RNA se vždy připojují na 3’ konci
k pokračování replikace
DNA je potřeba cukerná
složka s OH skupinou na
3' uhlíku
azidothymidin
1'
2'3'
4'
5'
Analogy nukleotidů s 3’ koncem neumožňujícím napojení
dalšího nukleotidu
Některá antivirotika jsou analogy nukleosidů, kde je 3’-uhlík cukerné složky
nahrazen jiným atomem bez OH skupiny, nebo je na něm navázána funkční
skupina neumožňující napojení dalšího nukleotidu za tento analog – replikace
DNA se v místě zapojení analogu nukleotidu zastaví
- zabraňují zároveň i reverzní transkripci (tvorbě DNA podle molekuly RNA)
léčiva požívaná při infekci virem HIV
lamivudin
1'
2' 3'
4'
5'
Analogy nukleotidů bez cukerné složky
Jiná antivirotika jsou analogy nukleotidů bez cukerné složky poskytující
3’-konec pro prodlužování řetězce DNA, tedy bez možnosti připojení dalšího
nukleotidu za tento analog – replikace DNA se v místě zapojení takového
analogu nukleosidu zastaví
gancyklovir
léčba například cytomegalovirových infekcí
(zánět plic u pacientů s imunosupresivní léčbou, atd.)
léčba například oparu nebo pásového oparu
Klinický případ
U pacientky (43 let) s metastazujícím nádorem prsu byly
zjištěné snížené markery apoptózy (ukazatele řízené buněčné
smrti, které nastává v buňkách například v důsledku
poškození DNA) – snížená tvorba proteinů Bcl-2 a TP53INP1,
které podporují apoptózu. Sekvenování ale neodhalilo žádné
mutace v DNA těchto dvou genů. Čím tedy může být snížená
tvorba těchto proteinů způsobena?
U pacientky (43 let) s metastazujícím nádorem prsu byly
zjištěné snížené markery apoptózy (ukazatele řízené buněčné
smrti, které nastává v buňkách například v důsledku
poškození DNA) – snížená tvorba proteinů Bcl-2 a TP53INP1,
které podporují apoptózu. Sekvenování ale neodhalilo žádné
mutace v DNA těchto dvou genů. Čím tedy může být snížená
tvorba těchto proteinů způsobena?
Změna exprese některých typů miRNA
byla zjištěna u mnoha typů nádorů
- například u nádorů prsu byla prokázána souvislost zvýšené exprese
miRNA-155 se zvýšenou malignitou nádoru a horší prognózou
(nižší pravděpodobnost vyléčení a přežití)
http://cebp.aacrjournals.org/content/21/8/1236.long
Cílové geny miR-155 jsou součástí signálních drah
souvisejících se vznikem a šířením nádorů
(EMT = metastazování; proliferation = dělení buněk;
apoptosis = řízená buněčná smrt, sustained
angiogenesis = tvorba nových cév)
Změna exprese některých typů miRNA
byla zjištěna u mnoha typů nádorů
- miRNA-155 – nový diagnostický marker – zvýšená exprese miRNA může
být v krevní plazmě detekovatelná i roky předtím, než nádor díky tomu
začne metastazovat a stane se maligním – včasný záchyt a včasné
zahájení léčby
- souvislost úbytku miRNA-155 v krevní plazmě s úspěšností chemoterapie
(ubývají nádorové buňky nadměrně exprimující tuto miRNA, a tím
přestávají podporovat zvýšenou malignitu zbytkových nádorových buněk)
→ klinické studie testující použití inhibitorů miRNA
jako protinádorové léčby u konkrétních pacientů
miRNA nemůže způsobit degradaci mRNA cílových genů
miRNA
TOPO-
ISOMERASE