Praktikum č. 2 MUDr. Zita Chovancová, Ph.D. Imunoglobuliny Polyklonální a monoklonální protilátky imunoglobuliny strukturálně příbuzné glykoproteiny produkované plasmatickými buňkami • vázané na membránu B lymfocytu – receptory zprostředkující aktivaci B lymfocytu • sekretované (rozpustné) – mediátory specifické humorální imunity protilátky imunoglobuliny namířené proti konkrétnímu antigenu antigen z anglického antibody generating substances struktury, na něž reaguje imunitní systém, a které reagují s produkty imunitní odpovědi (jejich součástí jsou antigenní determinanty neboli epitopy) • biochemicky – proteiny, cukry a jejich komplexy – čisté lipidy a nukleové kyseliny jsou slabé antigeny • původ – exogenní (mikroorganismy, alergeny, transplantované tkáně) – endogenní (krevně-skupinové substance, nádorové antigeny, „autoantigeny“) antigenicita a imunogenicita antigenicita schopnost specificky kombinovat finální produkty imunitní odpovědi imunogenicita schopnost antigenu vyvolat imunitní odpověď (protilátkovou nebo buněčnou, často obě) molekuly se schopností imunogenicity vykazují antigenicitu, ale naopak to neplatí odlišné pojmy, které se zároveň překrývají malá oblast molekuly antigenu, kterou rozeznávají receptory lymfocytů nebo protilátky i m u n o d o m i n a n t n í e p i t o p y podjednotky antigenní determinant, které jsou nejsnadněji rozpoznány imunitním systémem, a tak mohou nejvíce ovlivňovat specificitu indukované protilátky receptory lymfocytů T a B poznávají odlišné epitopy antigenních molekul antigenní determinanty (epitopy) antigenní determinanty (epitopy) B lymfocyty rozpoznávají epitopy na nativní molekule (sekvenční i konformační) repertoár BCR specificit je cca 1011 T lymfocyty rozpoznávají většinou lineární peptidy tvořené intracelulárně procesy (tzv. „přípravou antigenu k prezentaci“ pomocí antigen prezentujících buněk) repertoár TCR specifit je cca 1015 antigenní determinanty (epitopy) „antigen processing“ T lymfocyty nerozpoznávají nativní antigeny, proto je potřebná modifikace antigenu tak, aby byl T lymfocyty rozpoznán ANTIGEN PROCESSING  příprava antigenu k prezentaci variabilní oblast lehkého řetězce variabilní oblast těžkého řetězce konstantní oblast lehkého řetězce konstantní oblast těžkého řetězce NH2 NH2 NH2 NH2 COOHCOOH Fc Fab struktura imunoglobulinů 2 identické těžké řetězce (H) a 2 identické lehké řetězce (L) spojené disulfidickými můstky (tvořené strukturně podobnými doménami o 110–120 AMK  2 domény u L; 4–5 domén u H) • lehký i těžký řetězec – variabilní oblast (VH a VL); N-konec • každá oblast obsahuje 3 hypervariabilní úseky (6–10 AMK), které slouží pro vazbu antigenu – konstantní oblast (CL, CH1–CH3/CH4); C-konec • CL kappa nebo lambda lehké řetězce • CH izotyp imunoglobulinů (IgG, M, A, E, D) a podtřídy • flexibilita vazebné části – pantová oblast mezi CH1 a CH2 3 hypervariabilní oblasti imunoglobulinové molekuly variabilní oblast imunoglobulinové molekuly váže antigenní epitop Rearangement imunoglobulinových genů VDJ rekombinace děj, na jehož podkladě jsou vytvářeny komponenty tohoto genového nadrodu, a který je shodný pro vznik TCR a BCR receptorů • geny pro těžké řetězce na chromozomu 14 se skládají z malých skupin exonů kódujících konstantní oblasti těžkých řetězců a velmi velkého množství genů pro variabilní oblasti • mezi V a C geny jsou dvě malé skupiny exonů D a J • u jednotlivé buňky je vybrán jeden gen V oblasti a spojen s jedním genem z D a J sad na stejném chromozomu • vzniklý VDJ produkt je spojen dohromady na úrovni zpracování RNA s Cµ (tvorba IgM), s Cγ (tvorba IgG) Rearrangement imunoglobulinových genů Zárodečná konfigurace D to J rekombinace V to DJ rekombinace transkripce, splicing V segmenty D segmenty J segmenty exony konstantní oblasti AAA celá jednotka Upraveno dle Janewaye 2001 IgG • nejhojnější imunoglobulin v séru (7,5 – 15,6 g/l) • menší molekula snadno pronikající do tkání • vyskytuje se ve formě monomeru v sekreční i membránové vázané podobě • prochází placentou aktivním dějem (v placentě přítomné FcRn receptory pro Fc části IgG) • nejdelší biologický poločas (21 dní) • FUNKCE: klíčová úloha v sekundární imunitní odpovědi, aktivace komplementu, opsonizace, neutralizace vyskytuje se ve 4 podtřídách (IgG1–IgG4) podtřídy IgG IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 průměrná koncentrace v séru (g/l) 6,98 3,80 0,51 0,56 poločas rozpadu (dny) 21 21 7/21 21 přechod přes placentu ++++ ++ ++/++++ +++ Ab proti proteinům ++ +/- ++ ++ Ab proti polysacharidům + +++ +/- +/Ab proti alergenům + (-) (-) ++ aktivace komplementu (vazba C1q) ++ + +++ Vidarsson et al.: IgG Subclasses and Allotypes: From Structure to Effector Functions, Front Immunol. 2014; 5: 520. IgA • nejhojnější imunoglobulin na sliznicích, druhý nejhojnější imunoglobulin v séru (0,82 – 4,53 g/l) • vyskytuje se ve formě dimeru (spojení dvou monomerů J řetězcem) v sekreční a monomeru v membránově vázané podobě • neprochází placentou • biologický poločas (6 dní) • FUNKCE: klíčová úloha ve slizniční imunitě; neutralizace, opsonizace, neaktivuje komplement klasickou cestou aktivace vyskytuje se ve 2 podtřídách (IgA1–IgA2) sekreční IgA • IgA imunoglobuliny jsou produkovány plazmatickými buňkami a B lymfocyty v submukóze • transportovány na slizniční povrch pomocí transportního Fc receptoru (poly-Ig-receptor) • k transportu dochází přes epitel transcytózou (endocytóza – přeprava v transportním váčku – fúze s luminální membránou – odštěpení z receptoru proteolýzou) • část poly-Ig-receptoru zůstává po uvolnění na slizniční povrch součástí dimeru IgA (tzv. sekreční komponenta)  zajišťuje rezistenci vůči proteázám přítomným na slizničních površích proces sekrece IgA epiteliální povrch lumen lamina propria mucosae slizniční epiteliální buňky transportní váček proteolytické štěpení poly-Ig-receptor sekreční komponenta (zbytek poly-Ig-řetězce) dimer IgA plasmablast J-řetězec sekreční IgA IgM • velká molekula, která zprostředkovává zejména intravaskulární neutralizaci organismů (v séru 0,46 – 3,04 g/l) • vyskytuje se ve formě pentameru (teoreticky 10 vazebných míst) v sekreční a monomeru v membránově vázané podobě – tvoří receptor na B-lymfocytech – po navázání antigenu zprostředkuje aktivaci B lymfocytů – důležitý pro vývoj B lymfocytů • biologický poločas (6 dní) • FUNKCE: zajišťuje primární imunitní odpověď, účinná aktivace komplementu (nese 5 vazebných míst pro komplement, proto se významně uplatňuje v aktivaci komplementu klasickou cestou) IgE • v séru a tělních tekutinách jen velmi nízká koncentrace, protože většina IgE se váže na vysokoafinitní receptory na povrchu mastocytů, basofilů a eozinofilů (v séru 0,0003 g/l; proto 0–100 kU/l) • biologický poločas (2 dny) • FUNKCE: podílí se na zajištění obrany proti parazitárním infekcím IgD • v séru a tělních tekutinách jen velmi nízká koncentrace, protože je tvořen vyvíjejícími se B lymfocyty schopnými reagovat s antigenem (v séru 0–100 IU/ml) • tento imunoglobulin slouží výhradně jako povrchový receptor pro aktivaci B lymfocytů specifickým antigenem • biologický poločas (2,8 dní) • FUNKCE: není známá shrnutí biologických funkcí imunoglobulinových molekul • aktivace komplementového systému (IgG, IgM) • opsonizace (zejména IgG) • neutralizace antigenů (IgG, IgA, IgM) • zábrana adherence (IgA, IgG) • aglutinace, precipitace (IgG, IgM) • degranulace žírných buněk (IgE) • přechod placentou (IgG) • imunoregulace (zejména IgG) flexibilita protilátkové molekuly Antigenní determinanty dále od sebe Antigenní determinanty blížeji u sebev v interakce antigenu s protilátkou • Nekovalentní vazby: – elektrostatická – vodíkové můstky – van der Waalsovy síly – hydrofobní síly • afinita: síla interakce mezi epitopem a jedním vazebným místem protilátky • avidita: suma všech interakcí mezi protilátkou a antigenem interakce antigenu s protilátkou • vysoká diversita protilátek: > 1011 různých vazebných míst • komplementarita vazebného místa protilátky s epitopem antigenu – hypervariabilní oblasti VL a VH (CDR1, 2 a 3 – complementarity determining regions) – jedinečnost vazebného místa dána procesem VDJ (VJ) rekombinace a somatickými hypermutacemi • přístupnost epitopů v závislosti na konformaci antigenu vliv konformace antigenu (přístupnosti epitopu) na vazbu s protilátkou Vysoká afinita Nízká afinita Ab1 Ag2 Ab1 Ag1 afinita protilátek vyjadřuje sílu interakce mezi 1 epitopem daného antigenu a vazebným místem protilátky avidita protilátek vyjadřuje sílu interakce polyvalentní protilátky s polyvalentním antigenem (obsahuje více identických epitopů) Vývoj B lymfocytů, tvorba protilátek • pre-B lymfocyty (syntéza H řetězce IgM, VDJ rekombinace – pre-B receptor) • nezralé B lymfocyty (syntéza H i L řetězců IgM, VDJ (VJ) rekombinace, B-buněčný receptor) • zralé B lymfocyty (exprese IgM a IgD na povrchu B-buněčného receptoru) • vazba antigenu na BCR – aktivace a postupná diferenciace B lymfocytů do plazmatických buněk produkujících protilátky, vznik paměťových B lymfocytů – vyzrávání afinity – somatické hypermutace – izotypový přesmyk – převaha sekretované formy VDJ (VJ) rekombinace Zrání afinity Izotypový přesmyk exprese imunoglobulinů v průběhu maturace B lymfocytů PROTILÁTKY Imunoglobulin namířený proti konkrétnímu antigenu P O L Y K L O N Á L N Í směs imunoglobulinových molekul s různou specificitou (zpravidla proti různým epitopům 1 antigenu) příprava: imunizací zvířat M O N O K L O N Á L N Í produkt 1 klonu B lymfocytů s jedinečnou specificitou; produkce nádorem z plazmatickým buněk (myelomem) příprava: hybridomovou technologií Postuláty klonální selekční teorie každý lymfocyt má jeden typ receptoru s jedinečnou specificitou interakce mezi antigenní molekulou a receptorem schopným ji vázat vede k aktivaci lymfocytu buňky, které vznikly z aktivovaných lymfocytů proliferací a diferenciací mají receptory stejné specificity lymfocyty, které mají receptory pro tělu vlastní antigeny jsou v časném stadiu vývoje lymfoidních buněk odstraněny a tudíž v repertoáru zralých lymfocytů chybí („forbidden clones“) efektorové buňky antigen paměťové buňky eliminace autoreaktivních klonů krev a periferie expanze smrt buňky smrt buňky selekce klonu antigenem tvorba lymfocytů schopných reagovat potenciálně se všemi antigeny klonální selekční teorie Příprava imunoglobulinových preparátů polyklonální „antiséra“ (hyperimunní séra) • humánní • xenogenní • imunizace zvířat – králík, koza, prase, kůň… monoklonální protilátky • myší • modifikované (chimerické, humanizované, lidské) Typy „nespecifických“ imunoglobulinových derivátů intravenózní 5–10% roztok intaktních molekul IgG bez příměsi ostatních imunoglobulinových tříd subkutánní jedná se v podstatě o intravenózní deriváty zahuštěné na 16 % intramuskulární 16% roztok převážně IgG Indikace imunoglobulinové léčby substituce při nedostatečné tvorbě protilátek primární imunodeficience sekundární imunodeficience imunoregulace autoimunitní choroby vaskulitidy alergická onemocnění léčba infekčních chorob substituce i imunoregulace monoklonální protilátky protilátka pocházející z produkce jednoho klonu aktivovaných B lymfocytů (respektive jejich efektorových forem – tzv. plazmocytů) po styku s konkrétním antigenním epitopem tyto protilátky jsou dnes hojně využívány jak v základním výzkumu, tak v medicíně pro značení specifických molekul zejména při diagnostických laboratorních vyšetřeních příprava monoklonálních protilátek injekce konkrétního antigenu do experimentálního zvířete aktivaci B-lymfocytů s následnou produkcí protilátek (B-lymfocyty odebírány ze sleziny nebo jiného lymfatického orgánu) in vitro fúze linie myelomových buněk bez HGPRT a extrahovaných B-lymfocytů pomocí propylenglykolu vzniknou hybridomy (nesfúzované plazmocyty jsou in vitro velice konkurenčně slabé, nedělí se a hynou) příprava monoklonálních protilátek buněčná kultura je přenesena do média obsahujícího hypoxanthin, aminopterin a thymidin (HAT-medium) tímto zahynou i nezfúzované myelomové buňky (neobsahují enzym HGPRT a nejsou tak schopny využít deriváty purinů v živném HAT-médiu obsažené) hybridomové buňky naopak díky podílu normálních lymfocytů v genomu obsahují sekvenci pro enzym HGPRT a na HAT-mediu prosperují a proliferují nakonec pomocí speciálních testů z kultury vyděleny pouze hybridomy produkující jen jeden klon protilátek (monoklonální protilátky) nomenklatura monoklonálních protilátek • -mab (přípona pro monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty) • -umab (lidské) -omab (myší) • -ximab (chimerické) -zumab (humanizované) (další složky názvu mají vyjadřovat „terče“ : např. virové-vir, nádorové –tum, imunologické –lim, kardiovaskulární –cir, neurologické –ner, apod.) diagnostika • klasifikaci lymfocytů a jiných leukocytů • pomocí CD markerů metodou průtokové cytometrie) • diagnostika infekčních či systémových onemocnění nebo nádorů, pokud jsou známy specifické antigeny (protilátky) vyskytující se u těchto onemocnění (bez ohledu na příčinnou souvislost) • imunoanalýza, průtoková cytometrie využití monoklonálních protilátek terapie • v terapii, k zacílení buněk a molekul důležitých v patogenezi nemocí výzkum využití monoklonálních protilátek Hohlfeld R et al. (2005) Drug Insight: using monoclonal antibodies to treat multiple sclerosis; Nat Clin Pract Neurol 1 34-44 [doi: 10.1038/ncpneuro0016] typy používaných monoklonálních protilátek Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob • imunosuprese: - anti-CD3 (muromonab; OKT3): akutní rejekce u orgánových transplantací) - anti CD20 (rituximab): revmatoidní artritida, Bbuněčné nádory - anti-CD25(basiliximab, daclizumab): sclerosis multiplex • blokáda prozánětlivých cytokinů: : - anti-TNF-a (infliximab, adalimumab, golimumab): revmatoidní artitida, Crohnova choroba, ankylozující spondylitida, psoriatická artritida Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob • blokáda adhezivních molekul: – anti integrin-α4β1 (natalizumab): sclerosis multiplex – anti-CD11a (efalizumab): psoriáza • protialergická léčba: – anti-IgE (omalizumab): těžké formy astmatu • antiagregační léčba: – anti-trombocytární receptor gpIIb/IIIa (abciximab): prevence ischemických kardiálních komplikací u pacientů podstupujících perkutánní koronární intervenční zákrok, nestabilní angina pectoris • antivirová léčba: – RS virus (palivizumab): prevence infekce respiračním syncitiálním virem • protilátky proti antigenům bílých krvinek: – anti-CD20 (Rituximab): léčba lymfomů – anti-CD52 (Alemtuzumab): roztroušená skleróza • anti-receptorové protilátky: – anti-human epidermal receptor 2 (receptor HER-2) (trastuzumab): karcinom prsu, adenokarcinom žaludku – anti-epidermal growth factor (receptor EGFR) (cetuximab): kolorektální karcinom, spinocelulární karcinom hlavy a krku Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob