Lymfocyty jako základní operační jednotky adaptivní imunity. Diferenciální krevní obraz. Subpopulace T a B lymfocytů. Imunofenotypizace buněk imunitního systému na průtokovém cytometru. Funkční vyšetření vyšetření lymfocytů (proliferace, tvorba cytokinů, ELISPOT). Praktikum č. 4 MUDr. Zita Chovancová, Ph.D. • lymfatické tkáně a orgány • buňky imunitního systému • molekuly imunitního systému ZÁKLADNÍ SLOŽKY IMUNITNÍHO SYSTÉMU Imunitní reakce je zajišťována různými druhy buněk a molekul a jejich vzájemnými interakcemi. Buňky imunitního systému spolu s buňkami pojivovými a dalšími strukturami tvoří funkční a anatomické celky … LYMFATICKÉ TKÁNĚ A ORGÁNY • primární lymfatické orgány • THYMUS • KOSTNÍ DŘEŇ • sekundární lymfatické orgány • SLEZINA • LYMFATICKÉ UZLINY • ORGANIZOVANÉ SHLUKY LYMFATICKÉ TKÁNĚ – tonsily krční, nosní, jazyková, MALT, BALT, GALT s l e z i n a vyšetření sleziny U zdravých osob je slezina nehmatná. Hyposplenismus • vrozená asplenie • stavy po splenektomii • (význam vakcinace proti polysacharidovým antigenům – Str. pneumoniae, N. meningitidis) Splenomegalie: • hyperplasie buněk imunitního systému (infekce) • porušení průtoku krve (cirhóza jater, trombózy) • maligní procesy (primární i sekundární) • autoimunitní procesy (RA - Feltyho syndrom, SLE, hematologická onemocnění) • extramedulární hematopoéza l y m f a t i c k é u z l i n y vyšetření lymfatických uzlin Lymfadenopatie • blíže neurčené zvětšení lymfatických uzlin • Nejčastější příčiny zvětšení lymfatických uzlin: • imunitní reakce na antigen • infiltrace zánětlivými buňkami (lymfadenitida) • infiltrace a proliferace maligních buněk při imunologických (SLE, RA) a metabolických chorobách • U zdravých dospělých osob bývají axilární a inguinální uzliny hmatné (v průměru 1 cm). • V dětství je reakce lymfatických uzlin běžná. • U dospělých do 30 let je asi 80% lymfadenopatií benigních, u osob nad 50 let jen asi 40%. • Zvětšené uzliny mají diagnostický význam při infekci virem HIV. DIFERENCIÁLNÍ KREVNÍ OBRAZ odběr nesrážlivé krve do EDTA kojenci děti dospělí LEUKOCYTY 9 – 15 x 109/l 8 – 12 x 109/l 4 – 9 x 109/l GRANULOCYTY/POLYMORFONUKLEÁRY % % % neutrofilní granulocyty 25 - 65 35 - 70 55 - 70 • segmenty 22 - 65 25 - 65 50 - 70 • tyče 0 - 10 0 - 10 3 - 5 eozinofilní granulocyty 1 - 7 1 - 5 2 - 4 basofilní granulocyty 0 - 2 0 - 1 0 - 1 MONONUKLEÁRNÍ LEUKOCYTY % % % lymfocyty 20 - 70 25 - 50 25 – 40 monocyty 7 - 20 1 - 6 2 - 6 IZOLACE MONONUKLEÁRNÍCH BUNĚK z periferní krve Mononukleární buňky (PBMC) • leukocyty bez granulocytů (monocyty 20 %, lymfocyty 70 %) Postup izolace mononukleárních buněk: 1. plná krev se naředí v buněčném kultivačním médiu 2. naředěná krev se opatrně vrství na denzní médium (Ficol) 3. CENTRIFUGACE 4. na původním rozhraní mezi naředěnou krví a denzním médiem se vytvoří tzv. lymfocytární prstenec (lymfocyty a monocyty) • Gradientová centrifugace – Rozdělení buněk podle rozdílů v jejich hustotě Lymfocytární prstenec MONOCYTY A LYMFOCYTY RPMI + plasma + TROMBOCYTY separační médium (hustota 1,078g/ml) ERYTROCYTY A GRANULOCYTY IZOLACE MONONUKLEÁRNÍCH BUNĚK z periferní krve • ERYTROCYTY a GRANULOCYTY – na dně zkumavky • TROMBOCYTY – Zůstávají v séru a kontaminují mononukleární buňky – Jsou od nich odmyty v promývacích krocích • MNC – lymfocyty, monocyty (makrofágy) – 30% je tvořeno monocyty a makrofágy • Pokud je chceme oddělit, vložíme krok adherence na plastový povrch – monocyty a makrofágy adherují, zatímco lymfocyty zůstávají volně v supernatantu IZOLACE MONONUKLEÁRNÍCH BUNĚK z periferní krve proliferace buněk testy cytotoxicity průtoková cytometrie ELISPOT V y u ž i t í s e p a r o v a n ý ch M N C b u n ě k CD klasifikační systém (Paříž 1982) CD znaky (CD = cluster of differentiation) • molekuly buněčných membrán prokazované monoklonálními protilátkami (metodikou průtokové cytometrie) • dnes známých více než 350 CD znaků (9th International Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens (HLDA9), březen 2010) • Využití v klinické praxi: vyšetření absolutního a relativního zastoupení buněčných subpopulací pomocí průtokové cytometrie (v imunologii rutinně vyšetření T-lymfocytárních, B-lymfocytárních subpopulací a NK buněk) • Odběr: nesrážlivá krev (EDTA) LYMFOCYTÁRNÍ SUBPOPULACE CD ZNAKY PROCENTUÁLNÍ ZASTOUPENÍ Z LYMFOCYTŮ T lymfocyty CD3+ 58 – 85 % Th lymfocyty CD3+CD4+ 30 – 60 % z CD3+ Tc lymfocyty CD3+CD8+ 15 – 35 % z CD3+ B lymfocyty CD19+ 7 – 23 % NK buňky CD16+/56+ 6 – 20 % ZÁKLADNÍ SUBPOPULACE B-LYMFOCYTŮ BCR receptor: IgM – Ig,Ig – CD19,CD21,CD81 B1 B lymfocyty • minoritní subpopulace B lymfocytů • nachází se v pleurální a peritoneální dutině, částečně ve střevě • tvoří tzv. „přirozené protilátky“ B2 B lymfocyty • predominantní populace B lymfocytů • nachází se ve slezině a v lymfatických uzlinách tvořená v kostní dřeni v průběhu života • tvoří protilátky proti ostatním běžným antigenům ZÁKLADNÍ SUBPOPULACE T-LYMFOCYTŮ TCR receptor: CD3 komplex –  () – CD4/CD8 Th lymfocyty (CD3+CD4+) Th1 (IL-2, IFN-) Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) Th17 (IL-17, IL-22) Treg (IL-10, TGF-, IL-35) Tc lymfocyty (CD3+CD8+) NKT lymfocyty • po aktivaci tyto buňky produkují řadu cytokinů (vč. IFN- a IL-4) R e g u l a č n í T l y m f o c y t y • regulační T lymfocyty mají regulační a imunosupresivní funkci • tyto „na vlastní antigeny reagující“ T-lymfocyty se vytváří v thymu • jsou schopné aktivně suprimovat aktivaci další autoreaktivních T lymfocytů, které unikly negativní selekci v thymu • představují 5 – 10 % CD4+ T lymfocytů konstituční (přirozené) Treg (Foxp3+CD4+CD25+) • neproliferují při polyklonální stimulaci • tlumí reakce T lymfocytů přímým kontaktem indukované Treg • tlumí buňky Th1, Th2, ale i jiné buňky prostřednictvím cytokinů Tr1 (TGF-β) jejich tvorba může být navozena nevyzrálými dendritickými buňkami prezentujícími antigen v nepřítomnosti vhodných kostimulačních ligandů Th3 (IL-4, IL-10 a TGF-β) navození orální tolerance na potravinové antigeny navození tolerance potřebných komenzálních patogenů GIT R e g u l a č n í T l y m f o c y t y PŘEHLED BUNĚČNÝCH IMUNOLOGICKÝCH VYŠETŘENÍ V rámci imunologického vyšetření buněčných subpopulací stanovujeme: • absolutní a relativní počty buněk imunitního systému • Vycházíme ze stanovení celkového počtu leukocytů a diferenciálního krevního obrazu (absolutní a relativní počet lymfocytů, monocytů, granulocytů) • funkci buněk imunitního systému Vyšetření relativního a absolutního zastoupení lymfocytárních subpopulací PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE • využívá principu přímé imunofluorescence • buňky jsou inkubovány s protilátkou proti konkrétním CD znakům na povrchu buněk imunitního systému, která je označena fluorescenčním barvivem • buňky laminárně proudí tryskou přístroje vystaveny laserovému paprsku světla Vyšetření relativního a absolutního zastoupení lymfocytárních subpopulací PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE • každá buňka má na svém povrchu znaky, které tyto buňky charakterizují • toho se využívá při jejich detekci pomocí průtokové cytometrie CD4 CD3 CD19 CD3 CD8 CD16/56 NKB TcTh k plné periferní krvi se přidají monoklonální protilátky namířené proti buněčným povrchovým strukturám konjugované s fluorochromy dojde k vazbě příslušných monoklonálních protilátek se svými antigeny (povrchovými buněčnými strukturami) anti-CD8 anti-CD4 anti-CD3 anti-CD19 Th B Tc anti-CD19 anti-CD3 anti-CD3 anti-CD4 anti-CD8 Th B Tc CD3CD4 CD19 CD8CD3 buňky po jedné procházejí kyvetou, kde jsou ozářeny laserem a emitují světlo různé vlnové délky (dle použitého fluorescenčního barviva), které je zachyceno v soustavě detektorů kyvetalaser soustava detektorů emise světla o různé vlnové délce emise světla o různé vlnové délce Th TcB CD3 CD19 CD4 CD8 anti-CD19 anti-CD4 anti-CD3 anti-CD3 CD3 anti-CD8 B Vyšetření relativního a absolutního zastoupení lymfocytárních subpopulací PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE • na základě velikosti a granularity se buňky rozdělí na: o LYMFOCYTY, MONOCYTY a GRANULOCYTY • na základě navázání monoklonálních protilátek proti CD znakům na povrchu buněk se rozdělí na: o subpopulace T LYMFOCYTŮ, B LYMFOCYTŮ a NK BUŇKY Význam vyšetření pomocí průtokové cytometrie: • diagnostika primárních a sekundárních imunodeficiencí • diagnostika hematologických malignit VELIKOST GRANULARITA LYMFOCYTY MONOCYTY GRANULOCYTY A) Dot plot - stanovení procentuálního zastoupení pomocných CD3+CD4+ T-lymfocytů a CD3+4- T-lymfocytů. B) Histogram procentuálního zastoupení T-lymfocytů CD3+. • primární buněčné linie lymfocytů jsou odvozené z periferní krve nebo z lymfoidních orgánů • pouze model chování imunitního systému, protože ten je jinak velice komplexní!! • pěstování probíhá v definovaném bazálním médiu – obsahuje cukry, AMK, vitamíny, stopové prvky atd. (+ATB-penicilin, streptomycin…) při 37°C, 5%CO2, 95%vlhkost • podle typu pěstovaných buněk další přídavné látky (některé připraveny pomocí GI) • cesta, kterou objeveny mnohé funkce cytokinů a růstových faktorů Podmínky kultivace lymfocytů in vitro • normální buňky mají omezenou délku života – omezený počet dělení • pro srovnání experimentálních dat problém → pomocí karcinogenních látek či virů (SV40, EBV) lze dosáhnout transformace buněk na nesmrtelné a vytvořit tzv. buněčné linie Jurkat – lidské leukemické buňky produkující IL-2 HL-60 – lidské buňky odvozené od myeloidních leukemických buněk Podmínky kultivace lymfocytů in vitro Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace • Lymfocyty aktivovány • polyklonálními mitogeny • pro B lymfocyty • pokeweed mitogen (PWM) • pro T lymfocyty • phytohemagglutinin (PHA) • konkanavalin A (ConA) • specifickými antigeny • tuberkulin • tetanický toxoid Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace • izolace lymfocytů z periferní heparinizované krve • kultivace lymfocytů s mitogeny Tetanický toxoid – 7 dní PHA, PWM – 3 dny • přidání 3H-tymidinu den před koncem proliferace (2. den nebo 6. den) – inkorporace tymidinu do DNA dělících se buněk • stop proliferace zmražením • detekce radioaktivity beta-counterem • výsledek – stimulační index (SI) Poměr cmp (counts per minute) stimulované populace vůči aktivitě nestimulovaných buněk Pozitivní (SI  5 pro jednotlivé antigeny a SI  100 pro mitogeny a polyklonální aktivátory) Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace další možnosti stanovení proliferace buněk • stanovení exprese jaderného proteinu Ki-67 • tento protein je exprimován během všech aktivních fází buněčného dělení mimo klidovou G0 fázi → výsledkem je procento Ki-67 pozitivních lymfocytů • nevýhoda metody → protein Ki-67 se exprimuje už v G1 fázi buněčného cyklu, kdy se buňka k proliferaci teprve chystá, ale nemusí ji dokončit (například při selektivním působení cytostatik) • další metody stanovení proliferace → měření celkové DNA pomocí interkalačních sond, metoda inkorporace bromdeoxyuridinu (BrdU), metoda Click-iT® Plus EdU, měření proliferace metodou DELFIA Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro PROLIFERAČNÍ SCHOPNOST LYMFOCYTŮ jeden z fyziologických jevů buněčné aktivace Význam vyšetření proliferace lymfocytů: diagnostika závažných imunodeficientních stavů (podezření na SCID, deficit CD4+ T-lymfocytů) monitorování účinku onkologické léčby výzkumné účely • velmi časný nástup obtíží - první měsíce života • závažné a obtížně léčitelné infekce zejména bronchopulmonální, pokašlávání neodpovídající na běžnou antibiotickou léčbu • chronické průjmy, kdy ne vždy lze prokázat etiologické agens • kožní infekce a exantémy • neprospívání i při nepřítomnosti průjmů • komplikace po vakcinaci BCG SCID severe combined immunodeficiency • opakovaně nalezená lymfopenie • velmi nízké počty T-lymfocytů • počty B-lymfocytů a NK buněk jsou variabilní • obvykle nízké hladiny IgM a IgA, hladiny IgG nestoupají • porušená proliferativní odpověď po stimulaci mitogeny SCID severe combined immunodeficiency Funkční vyšetření lymfocytárních subpopulací in vitro další specializovaná funkční vyšetření • Produkce a uvolňování důležitých cytokinů a tím i funkční vyšetření subpopulací T lymfocytů (Th1 a Th2) • ELISA, ELISPOT, PCR • Vyšetření exprese molekul významných pro buněčné synapse nebo aktivačních znaků na povrchu buněk • průtoková cytometrie • Schopnost tvorby imunoglobulinů B lymfocyty • ELISA, ELISPOT Funkční vyšetření T lymfocytů in vivo TUBERKULINOVÝ TEST test pozdního typu přecitlivělosti (IV. typ imunopatologické reakce) • aplikace antigenu intradermálně (tuberkulin) na dorzální stranu levého předloktí • časový odstup odečtu reakce 24 – 48 hodin • vznik indurace a erytému v místě aplikace antigenu (hodnotí se pouze indurace) Funkční vyšetření T lymfocytů in vivo TUBERKULINOVÝ TEST test pozdního typu přecitlivělosti (IV. typ imunopatologické reakce) Pozitivní reakce indurace od 6 do 15 mm • normální odpověď u senzibilizovaného jedince indurace nad 15 mm (u dětí do 5 let nad 10 mm) • indikace k RTG vyšetření Negativní reakce indurace do 6 mm • pacient nebyl dříve senzibilizován • porucha odpovídavosti T lymfocytů Funkční vyšetření T lymfocytů in vivo TEST BUNĚČNĚ MEDIOVANÉ IMUNITY (CMI TEST, cell mediated immunity test) • intradermální aplikace tzv. anamnestických antigenů (tuberkulin, kandidin, toxoplasmin, tetanický toxoid, antigeny stafylokoků, streptokoků a další) • pokud pacient neodpoví tvorbou indurace v místě aplikace antigenu do 48 hodin, je porušena pravděpodobně jeho T-lymfocytární odpovídavost (anergní pacient)