Téma P05: Diagnostika Pasteurellaceae a G– nefermentujících tyčinek Ke studiu: Haemophilus, Pasteurella, Pseudomonas a G– nefermentující tyčinky (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, antigenní analýza Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Úkol 2 Kul-tiva-ce Růst na KA (A/N) Růstové charakteri-stiky na KA (ČA*) Endova p. (–/L-/L+^#) MH agar (barva) Úkol 3a Satelitový fenomén (+/–) Úkol 3b Růstové f. (X, V, X + V) Úkol 3c Aglutinace km. H. influenzae 3d Test citlivosti Penicil. Vanko. Fermentace gluk. Úkol 4 (Hajna) Oxidázový test Úkol 5a NEFERMtest 24 Úkol 5b KONEČNÝ ZÁVĚR *Pro bakterie nerostoucí na krevním agaru (KA) použijte čokoládový agar (ČA) ^#Neroste/roste a nefermentuje laktózu/roste a fermentuje laktózu Úkol 1: Mikroskopie suspektních kmenů Na stole máte kmeny popsané písmeny. Obarvěte je podle Grama, a do tabulky vepište výsledky. Kmen, který není G– tyčinka, nebude studován v úkolech 3 až 5 (ale v Úkolu 2 si ho pro srovnání popište) Úkol 2: Kultivace na agarových půdách Nejdříve napište, které bakterie rostou na krevním agaru a které ne. Pak, používajíce standardních procedur, popište kolonie všech kmenů na krevním agaru. Pouze ty, které na KA nerostou (demonstrační misku s naočkovanými, avšak nevyrostlými kmeny, naleznete na bočním stole), popište na čokoládovém agaru. Poté popište růst na Endově půdě: „–“ pokud nerostou, „L–“ pokud rostou, ale nefermentují laktózu „L+“ pokud laktózu fermentují. Dejte pozor: některé kmeny mohou předstírat pozitivitu laktózového testu, ačkoli jsou laktóza negativní: produkují pigmenty, takže kolonie jsou tmavé, avšak okolí je světlé. V případě pochyb porovnejte s TSI/Hajnovou půdou (Úkol 4): úplná žlutá barva = fermentuje glukózu i laktózu, úplná červená barva = nefermentuje glukózu ani laktózu, napůl červená a napůl žlutá = fermentuje glukózu, ale ne laktózu. Co se týče MH agaru: prověřte pouze jeden kmen, a to pouze na případnou přítomnost pigmentu. Použijte misku z Úkolu 1 nebo z Úkolu 6b (není žádná speciální miska s MH agarem pro Úkol 2). Úkol 3: Identifikace Pasteurellaceae a jejich přesnější určení a) Satelitový fenomén Hemofily jsou typické takzvaným satelitovým fenoménem. To znamená, že samy o sobě nerostou na krevním agaru, ale jsou tam schopny růst v přítomnosti kmene, který pro ně z krvinek uvolní růstové faktory. Pro tento účel se zpravidla používá kmen Staphylococcus aureus. Zakreslete satelitový fenomén (testován u dvou kmenů) a spojte popisky s příslušnými jevy na obrázku. Výsledek zapište do hlavní tabulky na první straně. Staphylococcus aureus Kolonie hemofilů b) Identifikace hemofilů podle potřeby růstových faktorů Určete dané kmeny podle potřeby růstových faktorů. Zakreslete výsledek faktorového testu pro oba kmeny. Hemofil praktika C c) Detekce kapsulárních antigenů H. influenzae Popište výsledek aglutinace kapsulárních antigenů H. influenzae pomocí latexové aglutinace (z prezentace). d) Detekce P. multocida pomocí typického vzorce citlivosti Velmi typická pro P. multocida je její citlivost k penicilinu, velmi vzácná u G– tyčinek. Na druhou stranu je rezistentní k mnohem silnějšímu (ovšem pouze pro G+ bakterie vhodnému) antibiotiku vankomycinu. Zapište. e) Potvrzení určení Pasteurella multocida pomocí MALDI-TOF Podívejte se na výsledky MALDI-TOF u našeho kmene pasteurely. Rozhodněte: Určení Pasteurella multocida z předchozích testů je – není (nehodící se škrtněte) potvrzeno MALDI-TOF. Úkol 4: Hajnova půda (Triple Sugar Iron Agar – TSI v modifikaci dle A. A . Hajny) Prohlédněte si kultivační výsledky čtyř kmenů na Hajnově půdě. Kmen, který fermentuje glukózu (žlutá barva) označte jako „+“, kmeny nefermentující (červená) jako „–“. Ostatní výsledky (laktóza, sirovodík) nejsou v tomto praktiku důležité, ale výsledek fermentace laktózy (úplná žlutá vs. červenožlutá barva) můžete případně použít pro porovnání s Úkolem 2. Úkol 5: Určení G– glukózu nefermentujících bakterií a) Oxidázový test Demonstrace oxidázového testu u tří kmenů určených jako G– nefermentující bakterie. Zapište výsledky do tabulky. (Pseudomonas je vždy pozitivní, Burkholderia většinou, ale ne nutně pozitivní; na druhou stranu, Stenotrophomonas bývá zpravidla negativní). Oxidáza pozitivní bakterie s typickou vůní a pigmentem (zpravidla zeleným, řidčeji modrým či zrzavým) je prakticky s jistotou Pseudomonas aeruginosa. U této bakterie tedy není nutno provádět další biochemické testování, popsané v úkolu 5a. U ostatních dvou kmenů je toto biochemické testování nezbytné. b) Podrobné biochemické testování Vyhodnoťte předložené výsledky NEFERMtestu 24, který byl připraven DVA dny předem (rozdíl oproti jiným biochemickým testům, kde je to jen jeden den) při 30 °C (další rozdíl; jiné testy vyžadují 37 °C). Také způsob odečítání testu je jiný, protože zde máme tři řady. Testy v horní řadě mají vždy hodnotu „1“, v prostřední „2“ a v dolní „4“. První číslice je z oxidázového testu: „0“ pro negativní, „1“ pro pozitivní oxidázu. Z reakcí v důlcích B a A se číslice nevypočítávají. Máme tedy sedmimístný kód – první pozice je „0“ (oxidáza –) nebo „1“ (oxidáza +) a dalších šest může nabývat hodnot 0 až 7 dle výsledku testů ve sloupcích H až C. Kmen: OX H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód Kmen: OX H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód Poznámky: Úkol 6: Testy citlivosti patogenů na antibiotika Mezi vašimi bakteriemi je pět patogenních: dvě z čeledi Pasteurellaceae a tři G– nefermentující. Z nich však budete měřit velikosti zón jen pro pseudomonádu. Zapište celé názvy antibiotik a změřte velikost zón. Zapište kmeny jako citlivé (C) resistentní (R) a intermediární (I). 6a) Test pro hemofila (jako Haemophilus influenzae byl určen kmen ___) Antibiotikum (celé jméno) Æ zóny (mm) Interpr. Penicilin (P) C ≥ 12 / R < 12 Ko-amoxicilin (AMC) C ≥ 15 / R < 15 Cefuroxim (CXM) C ≥ 26 / R < 26 Kys. nalidixová (NA) C ≥ 23 / R < 23 Tetracyklin (TE)* C ≥ 25 / R < 22 *platí i pro doxycyklin Ko-trimoxazol (SXT) C ≥ 23 / R < 20 6b) Test pro pasteurellu (jako Pasteurella multocida byl určen kmen ___) Antibiotikum (celé jméno) Æ zóny (mm) Interpr. Ko-amoxicilin (AMC) C ≥ 15 / R < 15 Cefotaxim (CTX) C ≥ 26 / R < 26 Ciprofloxacin (CIP) C ≥ 27 / R < 27 Tetracyclin (TE)* C ≥ 24 / R < 24 Ko-trimoxazol (SXT) C ≥ 23 / R < 23 Penicilin (P) C ≥ 17 / R < 17 6c) Test pro pseudomonádu (jako pseudomonáda byl určen kmen ___) Antibiotikum Æ zóny (mm) Interpr. Antibiotikum Æ zóny (mm) Interpr. Piperacilin+tazobaktam (TZP) C ≥ 18 / R < 18 ciprofloxacin (CIP) C ≥ 26 / R < 26 gentamicin (CN) C ≥ 15 / R < 15 ceftazidim (CAZ) C ≥ 17 / R < 17 ofloxacin (OFL) C ≥ 16 / R < 13 kolistin (CT) C ≥ 11 / R < 11 Poznámka: Tazobaktam působí jako inhibitor betalaktamázy, zároveň ale má i svoji vlastní antimikrobiální účinnost. 6d) Kontrola primárních rezistencí u kmenů burkholderie a stenotrofomonády Primární rezistence GNFB Ve výše uvedené tabulce přirozených rezistencí, vydané organizací EUCAST#, vidíte přirozené rezistence u nejběžnějších gramnegativních nefermentujících bakterií. Na bočním stole vidíte testy citlivosti u burhkolderie a stenotrofomonády. Není třeba měřit zóny, jsou již změřeny. # EUCAST = The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Na víčku Petriho misky můžete najít: 1. sloupec: přirozené rezistence daného kmene (opsané z tabulky EUCAST nahoře): „R“ = kmen je přirozeně rezistentní, „–“ = kmen není přirozeně rezistentní. Jsou zde zapsány pouze přirozené rezistence na antibiotika z naší sestavy (PS1). Poznámka: Tabulka nahoře neobsahuje ofloxacin (OFX), ale kmeny primárně rezistentní k ciprofloxacinu můžeme považovat za rezistentní i k ofloxacinu. Tabulka také jmenovitě neobsahuje gentamicin (CN), ale výsledek může být odvozen od „Aminoglykosidů“. 2. sloupec: výsledky měření zón a jejich porovnání s referenční zónou: S = citlivý (susceptible), R = rezistentní Zapište na následující stranu, jaké jsou podle EUCAST přirozené rezistence B. cepacia a S. maltophilia (opište z prvního sloupce). Poté zkontrolujte, zda jsou všechny přirozené rezistence vyjádřeny podle následující tabulky: Přirozená rezistence (R)? Změřeno jako Závěr – citlivé (S) výsledek je v souladu, kmen lze dát do výsledku jako „citlivý“ R rezistentní (R) výsledek je v souladu, kmen musí figurovat ve výsledku jako „rezistentní“ – rezistentní (R) výsledek je v souladu, kmen musí figurovat ve výsledku jako „rezistentní“ (jde o sekundární rezistenci) R citlivé (S) výsledek není v souladu, kmen je třeba dát do výsledku jako „rezistentní“, můžeme hovořit o „falešné citlivosti“ Nakonec ještě zapište, zda je kmen citlivý na některá antibiotika (zapište kmen jako citlivý jen na ta antibiotika, u kterých může tento výsledek být uveden ve výsledku, tj. nikoli u těch, které byly změřeny jako citlivé, ale je nutno je kvůli přirozené rezistenci považovat za rezistentní). Zapište: Kmen ___ (S. maltophilia) je podle EUCAST primárně rezistentní na tato antibiotika: ____________________ _________________________________________________________________________________________. Citlivost zjištěná difusním diskovým testem s tímto souhlasí (= není tu žádná „falešná citlivost“) nesouhlasí v případě tohoto antibiotika či těchto antibiotik: _______________________________________ Kmen je citlivý na antibiotika: _________________________________________________________________ Kmen ___ (B. cepacia) je podle EUCAST primárně rezistentní na tato antibiotika: _______________________ _________________________________________________________________________________________. Citlivost zjištěná difusním diskovým testem s tímto souhlasí (= není tu žádná „falešná citlivost“) nesouhlasí v případě tohoto antibiotika či těchto antibiotik: _______________________________________ Kmen je citlivý na antibiotika: _________________________________________________________________ Poznámka: Pokud je však diskrepancí více, je zpravidla vhodné ověřit citlivost kvantitativními testy, případně zkontrolovat, zda bylo správně provedeno rodové a druhové určení kmene. Úkol 7: Vztahy bakterií ke kyslíku – porovnání enterobakterií, G– nefermentujících a anaerobů Podívejte se na bujóny kultivované za aerobních a anaerobních podmínek (vrstva parafinu na povrchu), vyhodnoťte růst bakterií a jeho charakter. Kmen Růst v bujónu Růst ve VL bujónu Závěr