Téma P07: Diagnostika anaerobních bakterií Ke studiu: Clostridium; nesporulující anaeroby (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, pokus na zvířeti, neutralizace Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 4 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N Gramovo barvení – Úkol 1b (včetně případných údajů o tvorbě spor) Kultivace: úkol 3 2 Krevní (“KA”) Růst A/N VL agar (“VLA”) Růst A/N VL bujón Růst A/N Popis kolonií na KA/VLA* KONEČNÝ ZÁVĚR (výsledek Úkolu 4 – ANAEROtest, nebo, u „ne-anaerobů“, výsledky předchozích testů) *Použijte VLA (VL agar) u mikrobů, které nerostou na krevním agaru Úkol 1: Mikroskopie klinického vzorku a mikroskopie kmene a) Prohlídka klinického vzorku ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si Gramem barvený preparát. Pravděpodobně najdete směs různých bakterií, jak je to u anaerobních infekcí typické: za infekci nemůže jeden patogen, ale směs patogenů. Vedle bakterií můžete vidět leukocyty (zejména polymorfonukleráry), případně epitelie, tkáňovou drť a tak dále. Nezapomeňte obrázek popsat (použijte čáry)! b) Mikroskopie podezřelých kmenů Anaerobní bakterie mohou být koky i tyčinky, grampozitivní i gramnegativní; v tom se neliší od jiných bakterií. Bývají ale pleomorfnější. U rodu Clostridium je přítomnost a pozice endospor užívána jako významný diagnostický znak. Pokuste se u jednoho z vašich kmenů (robustní G+ tyčinky) endospory najít. Úkol 2: Anaerostat a anaerobní box K získání anaerobiózy používáme v naší laboratoři tři způsoby: a) pro tekuté půdy se jako bariéra médium/atmosféra používá parafinový olej (není dokonalé) b) pevné půdy dáváme do anaerostatu, kde je kyslík chemicky nahrazen směsí plynů c) pevné půdy lze také umístit do anaerobního boxu; anaerobní atmosféra je vháněna z tlakové lahve (bomby). Vepište do obrázků svůj popis (anaerostat uvidíte doopravdy a spolu s anaerobním boxem také na obrázku). Úkol 3: Kultivace na agarových půdách Popište kultivační výsledky daných kmenů na aerobních i anaerobních půdách. a) Aerobní kultivace na krevním agaru (KA) Napište, zda bakterie rostou či nikoli, případně též popište jejich kolonie. b) Anaerobní kultivace na VL agaru (VL krevním agaru) VL (krevní) agar je podobný krevnímu agaru, ale má snížený redoxní potenciál a kultivuje se v anaerostatu či anaerobním boxu. Napište, které kmeny zde rostou a ty, které nerostly na KA, popište. c) Pomnožení anaerobů ve VL bujónu VL bujón se používá pro pomnožení málo početných anaerobních bakterií. Zkontrolujte přítomnost zákalu (růstu) ve VL bujónu a porovnejte s výsledky části b). Úkol 4: Druhová diagnostika anaerobů biochemickými testy U kmenů určených jako anaeroby použijeme biochemický mikrotest (ANAEROtest 23 Erba-Lachema) naočkovaný o dva dny dříve. Odečtěte podle schématu. Pozor, kódová kniha má tentokrát čtyři části, musíte tedy najít správnou část dle výsledků mikroskopie. Výsledky sloupců „B“ a „A“ se při výpočtu kódu nezapočítávají, získáte tedy šestimístný kód za sloupce H až C. U druhého z kmenů vyjdou dvě možnosti výsledku. Předpokládejte, že tento kmen byl již testován na citlivost na penicilin a byl shledán citlivým. Nejde tedy o zástupce (primárně na penicilin resistentního) rodu Bacteroides. Kmen: H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód Kmen: H G F E D C B A Kód: 1 Identifikace: 2 % pravděpodobn.: 4 Index typičnosti: Kód Poznámky: Úkol 5: Citlivost anaerobů na antibiotika Anaerobní bakterie bývaly testovány difusním diskovým testem, avšak bylo prokázáno, že difusní diskový test není pro anaerobní bakterie dostatečně spolehlivý. V současnosti se dle instrukcí EUCAST se infekce způsobené anaerobními bakteriemi buďto léčí bez in vitro testování, nebo, zvláště u závažných infekcí, se k in vitro testování používají E-testy. Odečtěte E-test na anaerobní bakterii. Zakreslete jeden z výsledků, vyhodnoťte všechny výsledky. Nezapomeňte, že i když je principiálně podobný jako difusní diskový test, je E-test kvantitativním testem. Hodnoty koncentrací jsou napsány přímo na proužku. Místo, kde okraj zóny kříží proužek, nám ukazuje hodnotu minimální inhibiční koncentrace (MIC). Kmen Kmen ___ určený jako _______________ Kmen ___ určený jako _______________ Antibiotikum â Kritéria Hodnota MIC Závěr Kritéria Hodnota MIC Závěr Klindamycin (DA) C když MIC ≤ 4 R když MIC > 4 C když MIC ≤ 4 R když MIC > 4 Amoxicilin/ klavulanát (AMC) C když MIC ≤ 4 I když MIC = 8 R když MIC > 8 C když MIC ≤ 4 I když MIC = 8 R když MIC > 8 Metronidazol (MTZ) C když MIC ≤ 4 R když MIC > 4 C když MIC ≤ 4 R když MIC > 4 Všechny hodnoty jsou v mg/l. C = citlivý, I = intermediární, R = resistentní Úkol 6: Detekce toxinů klostridií U klostridií se používají různé testy produkce toxinu. a) Průkaz toxinu (lecitinázy) Clostridium perfringens a) Clostridium perfringens tvoří specifickou lecitinázu, neutralizovatelnou specifickou protilátkou. Polovina vaší misky je potřena protilátkou (anti-lecitinázou), druhá potřena není. Toxický efekt lecitinázy spatříte jako oblast precipitace kolem kmene na žloutkovém agaru. Pravý toxin je neutralizován antitoxinem, jiné lecitinázy neutralizovány nejsou. Zakreslete výsledek do obrázku a přičiňte popis. b) Průkaz toxinu Clostridium tetani b) Zakreslete (dle prezentace) obrázek tetanické myši. Povšimněte si pozice ocásku a končetin. c) Detekce A a B toxinů Clostridium difficile Pseudomembranózní kolitida způsobená toxiny Clostridium difficile je velmi nebezpečná, zejména u hospitalizovaných pacientů. Patogena je možno kultivovat na speciálních médiích, ale doporučuje se spíše provést test na toxiny a strukturální antigen. Testování se provádí imunochromatografickým testem, který je podobný např. těhotenskému testu nebo testům z jarního praktika na průkaz pneumokokového a legionelového antigenu, ale je složitější: zjišťuje se jak produkce klostridiového antigenu, tak i jeho toxinů. Pro praxi je důležité, že na toto vyšetření je nutno zasílat vzorek stolice (nestačí výtěr z konečníku). Stolice by měla být tekutá – pokud je formovaná (kusová), není zřejmě důvod toto vyšetření provádět. Test se skládá ze dvou částí, v obou případech se pozitivita projeví přítomností příslušné linie (modré čáry): (1) test přítomnosti klostridiového strukturálního antigenu a (2) SPOLEČNÝ test toxinů A a B (pozitivní linie je výsledkem přítomnosti toxinu A nebo B nebo obou). Interpretace testu: Toxin pozitivní, antigen pozitivní (Situace 1) Pokud odpovídají příznaky, infekci Clostridium difficile (CDI) lze považovat za prokázanou a léčbu za nezbytnou. Po léčbě se neprovádí kontrolní testování; klinický průběh vypovídá o efektu léčby lépe. Toxin negativní, antigen pozitivní (Situace 2) Při odpovídajících příznacích je stale nutno CDI považovat za možnou či dokonce pravděpodobnou, protože výsledek průkazu toxinu nelze považovat za zcela spolehlivý. Podle klinického stavu se tedy volí i léčba.* Toxin i antigen negativní (Situace 3) CDI je považována za velmi nepravděpodobnou Toxin pozitivní, antigen negativní Chyba testu Chybění tří teček (kontrola) Chyba testu *Také se doporučuje pokusit se o kultivaci kmene Clostridium difficile (ze stejného vzorku) a poté zopakovat tento test s tím, že místo vzorku stolice se použije tento vypěstovaný kmen. Prohlédněte výsledek průkazu antigenu Clostridium difficile (CD) a klostridiových toxinů A + B u vzorků stolice X, Y a Z a zapište výsledky: Pacient Kontroly Toxiny A + B CD Antigen CD Číslo situace (1/2/3) X OK – není OK pozitivní – negativní pozitivní – negativní Y OK – není OK pozitivní – negativní pozitivní – negativní Z OK – není OK pozitivní – negativní pozitivní – negativní