Téma P08: Laboratorní diagnostika tuberkulózy, aktinomykózy a nokardózy Ke studiu:Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, antimikrobiální citlivost, PCR Úkol 1: Mikroskopie acidorezistentních a vláknitých mikroorganismů Zatímco acidorezistentní mikroorganismy (Mycobacterium) nelze barvit dle Grama, mikroby acidorezistentní pouze částečně (Nocardia) nebo vůbec (Actinomyces) mohou být Gramem obarveny. Nokardie a aktinomycety mají podobu grampozitivních větvených vláken, ale často vidíme i kratší tyčinky nebo dokonce koky. a) Barvení (negativního) klinického vzorku barvicí metodou dle Ziehl-Neelsena ________________________________________________________________________________ Ziehl-Neelsenovo barvení se používá u mykobakterií (M. tuberculosis, M. leprae), ale zejména ve „studené“ variantě dle Kinyouna také u některých parazitů (Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis). Acidorezistentní organismy se barví pouze při zahřátí nebo při použití vysoce koncentrovaného karbolfuchsinu a vysoce koncentrovaného fenolu („studená“ varianta = modifikace podle Kinyouna). Zato je pak neodbarví ani kyselý alkohol (alkohol s anorganickou kyselinou). Poté je odbarvené pozadí obarveno kontrastní barvou – buď zelenou, nebo modrou. Obarvěte negativní vzorek sputa de Ziehl-Neelsena (klasická „teplá“ varianta, podvarianta s methylenovou modří). Mikroskopujte. Zde acidorezistentní tyčinky nenaleznete. Zakreslete výsledky, uvidíte především přirozené pozadí, tj. leukocyty, epitelie a další objekty. Nezapomeňte obrázek popsat (za použití řádků vedle obrázku). Popište také barvicí proceduru – do následující tabulky zapište názvy činidel používaných při barvení 1. Během barvení se preparát , dokud 2. Činidlo je směsí a 3. Místo tohoto barviva lze použít také b) Mikroskopie mykobakteriální kultury ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si v mikroskopu (imerze, imerzní objektiv) mykobakteriální kulturu barvenou dle Ziehl-Neelsena. Zaznamenejte zejména přítomnost acidorezistentních tyčinek. Zakreslete pozorované. Nezapomeňte obrázek popsat (za použití řádků vedle obrázku). c) Mikroskopie kmenů aktinomycet a nokardií ________________________________________________________________________________ Prohlédněte si mikroskopicky Gramem barvené sklíčko. Popište a zakreslete pozorované objekty. Povšimněte si velkého polymorfismu organismů (od kokovitého tvaru přes tyčinky až po vlákna, často větvená); grampozitivní, ale často až gramlabilní). Opět obrázek i popište. Úkol 2: Kultivace mykobakterií, aktinomycet a nokardií Kultivační nároky acidorezistentních a částečně acidorezistentních bakterií jsou velmi různorodé. v Pro Mycobacterium tuberculosis používáme tekuté (Šula, Banič) a pevné půdy (Ogawa, Löwenstein-Jenssen). Pevné půdy se liší od většiny půd používaných v bakteriologii, protože neobsahují agar; jejich „pevnost“ je dána koagulovanou vaječnou bílkovinou. Před kultivací je nutno vzorky mořiti. v Pro rod Nocardia postačuje běžný krevní agar. v Pro rod Actinomyces je nutný VL-agar a kultivace v anaerostatu či anaerobním boxu (viz P07), protože jsou mikroaerofilní s tím, že jejich potřeba kyslíku je tak nízká, že jim vyhovuje anaerobní prostředí. a) Popište půdy pro kultivaci mykobakterií Název půdy tekutá/pevná barva poznámky b) Popište a zakreslete růst kolonií rodů Mycobacterium, Actinomyces a Nocardia na (v) daných médiích Baktérie Název půdy Přítomnost/nepřítomnost růstu, případně charakterizace růstu (charakterizujte růst vlastními slovy) Mycobacterium Actinomyces krevní agar anaerobní WCHA agar Nocardia krevní agar anaerobní WCHA agar Úkol 3: Určení citlivosti na antimikrobiální látky K léčbě mykobakteriálních infekcí se používají speciální léky zvané antituberkulotika. Liší se také způsob testování citlivosti: antituberkulotika se přímo přidávají do půdy. Zato infekce působené rody Actinomyces a Nocardia se léčí „normálními“ antibiotiky a citlivost se testuje „normálním“ difusním diskovým testem. a) Určení citlivosti mykobakterií na antituberkulotika Porovnáním s kontrolní zkumavkou odečtěte testy citlivosti kmenů mykobakterií na antituberkulotika. Antituberkulotikum Kontrola růstu Růst A/N Interpretace b) Citlivost na antibiotika u kmenů Nocardia a Actinomyces Proveďte in vitro testování citlivosti na antibiotika u nokardií a aktinomycet. Na stole naleznete difusní diskové testy. Do tabulky dopište zkratky antibiotik dle přiložené kartičky a pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivosti. Na kartičce máte napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C) či rezistentní (R). „Intermediární“ interpretace v tomto případě nemáme. Kmen Antibiotikum (celé jméno) Æ zóny (mm) Interpretace Æ zóny (mm) Interpretace Úkol 4: PCR v diagnostice TBC Jelikož je kultivace mykobakterií obtížná, stává se PCR velmi důležitou diagnostickou metodou. Odečtěte výsledek PCR TBC (z prezentace), zapište a interpretujte výsledky Pacient č. Proužek vzorku Interní kontrola Interpretace 1 2 3 4 Úkol 5: Diagnostika lepry Lepra je nemoc, která stále postihuje miliony lidí v méně rozvinutých zemích. Její diagnostika je obtížná. Vyplňte následující tabulku. Toto zvíře se jmenuje Používá se k výrobě a tato látka se používá při Zdroj obrázku: http://www.1-costaricalink.com/costa_rica_fauna/nine_banded_armadillo.htm Úkol 6: Nepřímý průkaz TBC pomocí testu QUANTIFERON^©-TB Gold Jde o test vyšetření indukovaného uvolňování interferonu gama k ověření buněčné imunity. Princip testu: Bylo prokázáno, že při tuberkulóze, a to i latentní, dochází k tomu, že tuberkulózní antigeny aktivují T-lymfocyty a ty tvoří velká množství interferonu gama. Podobně lze tyto T-lymfocyty aktivovat nespecificky např. takzvaným mitogenem, ten se proto používá jako pozitivní kontrola (MIT). Jako negativní kontrola je použita zkumavka, která nic neobsahuje (NIL). Hodnota „TB“ představuje množství uvolněného interferonu po stimulaci vlastním antigenem TBC. Samotný interferon je přitom detekován pomocí reakce ELISA. Interpretujte vyšetření testem Quantiferon-TB Gold u čtyř pacientů s využitím interpretační tabulky. Anna: MIT = 4,8 TB = 1,2 NIL = 1,1 Vaše interpretace: _____________________ Berta: MIT = 5,3 TB = 4,8 NIL = 2,1 Vaše interpretace: _____________________ Cecil: MIT = 0,9 TB = 0,9 NIL = 0,8 Vaše interpretace: _____________________ Dimos: MIT = 8,4 TB = 8,3 NIL = 8,2 Vaše interpretace: _____________________ (všechny hodnoty jsou uvedeny IU/ml) Interpretační tabulka (podle doporučení k testu, zjednodušeno!) NIL TB mínus NIL MIT mínus NIL Konečná interpretace testu Přítomnost infekce M. tuberculosis ≤ 8,0 < 0,35 ≥ 0,5 negativní Nepravděpodobná ≥ 0,35 jakákoli hodnota pozitivní Pravděpodobná < 0,35 < 0,5 nejistá Nelze určit > 8,0 jakákoli hodnota jakákoli hodnota Poznámka: Vylepšená verze testu QUANTIFERON zahrnuje čtyři (a ne tři) zkumavky, jelikož „TB“ je nahrazeno dvěma typy antigenů. Nicméně pro zjednodušení zde počítáme s klasickou variantou testu.