Téma P06: Diagnostika některých dalších gramnegativních bakterií (Neisseria, Moraxella, Bordetella, Legionella, Francisella…..) Ke studiu: Haemophilus, Neisseria, Moraxella, Bordetella, Legionella, Francisella (učebnice, WWW…) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická kultivace, aglutinace Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 4 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Gramovo barvení kmene – Úkol 1b Kultivace Úkol 2 “Chudý” KA (“KA”) Růst A/N “Bohatý” KA (“KA+”) Růst A/N Čokoládový agar Růst A/N Popis kolonií na KA+* Úkol 3 a) Oxidázový test (+/–) b) Indoxylacetátový (INAC) test KONEČNÝ ZÁVĚR (výsledek úkolu 4 – NEISSERIAtest, resp. úkolu 1 pro kmen který není gramnegativním kokem) *U bakterií nerostoucích na KA+ použijte výsledek růstu na ČA Úkol 1: Mikroskopie klinického vzorku a mikroskopie kmene a) Pozorování uretrálního nátěru u kapavky bílé krvinky G– koky ve dvojících ________________________________________________ Prohlédněte si Gramem barvený nátěr. Nevšímejte si jen bakterií, ale také buněk makroorganismu, zejména leukocytů. Povšimněte si, že koky nejsou přítomny v každém leukocytu. Zakreslete, a spojte popisky objektů s pozorovanými objekty na obrázku. Poznámka: Velmi podobně by také vypadala mikroskopie u hnisavého mozkomíšního moku v případě akutní meningokokové meningitidy. b) Mikroskopie suspektních kmenů – hledání G– koků Na stole máte sklíčka s kmeny obarvenými podle Grama. Prohlédněte je a zapište výsledky do tabulky. Kmen, který není G– kokem, nebude studován v úkolech 3 a 4; ve druhém úkolu si jej však pro srovnání popište také. Úkol 2: Kultivace na agarových půdách Zapište do tabulky, které bakterie rostou na „chudém KA“, „bohatém KA“ a na čokoládovém agaru. Ústní druhy neisserií stejně jako moraxely a většina G+ koků rostou i na chudším krevním agaru. Neisseria meningitidis („meningokok“) roste jen na bohatších krevních agarech. Neisseria gonorrhoeae (gonokok) na krevním agaru neroste vůbec, je nutný čokoládový agar. Poté popište kolonie všech kmenů na KA+, jen kmen, který tam neroste, popište na ČA. Výsledky zapište do tabulky. Úkol 3: Základní biochemické testy u G– koků Oba testy budou prováděny demonstračně na bočním stole. Zapište výsledky do tabulky. a) Oxidázový test k odlišení neisserií a moraxel od případných jiných G- koků Učitel se dotkne několika kolonií kmenů identifikovaných jako G– koky oxidázovým diagnostickým papírkem. V případě pozitivity se během několika vteřin objeví modré zbarvení. Zakreslete a zapište výsledky do tabulky. Oxidáza b) Indoxylacetátový test k odlišení Moraxella (Branhamella) catarrhalis od neisserií Postup je podobný jako u oxidázového testu, ale proužek musí být předem zvlhčen, místo modré barvy pozorujete barvu modrozelenou a výsledek není viditelný okamžitě, ale je třeba několik minut počkat. Zakreslete pozitivní a negativní výsledek a zapište výsledky do tabulky. Oxidáza Úkol 4: Druhová diagnostika neisserií a moraxel (branhamel) biochemickými testy U kmenů určených jako G– koky odečtěte biochemický mikrotest (NEISSERIAtest fy Lachema) naočkovaný předchozí den. Odečtěte podle schématu. První jamka obsahuje negativní kontrolu (NEC), takže vlastní test začíná až od DRUHÉ jamky! Zakápnutí Lugolovým roztokem již bylo provedeno, nemusíte je provádět sami. Povšimněte si nízké biochemické aktivity některých neisserií. Porovnejte výsledek s růstovými vlastnostmi (kmen určený jako gonokok by měl růst pouze na čokoládovém agaru, meningokok pouze na čokoládovém a bohatém krevním agaru). Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Kmen: H G F E D C B A NEC Kód: Identifikace: × 1 2 4 1 2 4 1 × Úkol 5: Test citlivosti G- koků na antibiotika Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako G– koky a které patří k patogenním druhům. U Moraxella catarrhalis vzhledem k pouze hraniční patogenitě test odečítat nebudete. Pro všechny testované kmeny změřte zóny citlivosti. V protokolu máte napsány hraniční zóny – podle nich interpretujte zóny vámi zjištěné jako citlivé (C), rezistentní (R) a případně intermediární (I). a) Citlivost meningokoka (kmen ___) k antibiotikům Aktuálně se testuje u meningokoka citlivost k penicilinu E-testem a ostatní citlivosti difusním diskovým testem. Antibiotikum (hranice v mm) Æ zóny (mm) Interpretace Cefotaxim (CTX) C ≥ 34 R < 34 Meropenem (MEM) C ≥ 30 R < 30 Antibiotikum (hodnoty breakpointu v µg/ml) MIC (µg/ml) Interpr. Azithromycin (AZM) C ≥ 20 R < 20 Penicilin (P) C ≤ 0,06 R > 0,25 Ciprofloxacin (CIP) C ≥ 35 R < 33 b) Citlivost gonokoka (kmen ___) k antibiotikům Aktuálně se testuje u gonokoka citlivost k penicilinu a cefotaximu E-testem a ostatní citlivosti difusním diskovým testem. Antibiotikum (hranice v mm) Æ zóny (mm) Interpretace Cefuroxim (CXM) C ≥ 31 R < 26 Antibiotikum (hodnoty breakpointu v µg/ml) MIC (µg/ml) Interpr. Azithromycin (AZM) C ≥ 25 R < 25 Penicilin (P) C ≤ 0,06 R > 1 Tetracyklin (TE) C ≥ 38 R < 30 Cefotaxim C ≤ 0,12 R > 12 Ciprofloxacin (CIP) C ≥ 41 R < 28 Úkol 6: Přímý průkaz antigenů původců meningitid v mozkomíšním moku (demonstrace diagnostické soupravy a videoklip) Meningokoková meningitida je závažná choroba. Nelze zde čekat na kultivaci, je nutno využít rychlých diagnostických metod. Vedle mikroskopie se zde využívá především latexové aglutinace. a) Demonstrace soupravy k latexové aglutinaci Prohlédněte si soupravu a zapište názvy mikrobů, které mohou být touto metodou diagnostikovány. b) Videoklip Prohlédněte si videoklip. V této ukázce se jako patogen projevil __________________________________ Úkol 7: Diagnostika bordetel, brucel, legionel a francisel a) Diagnostika bordetel Diagnostika pertuse je v současnosti založena na serologii (aglutinace a ELISA), která vždy vyžaduje dva vzorky séra. Jinou diagnostickou metodou je PCR. Nicméně důležitou a klasickou metodou stále zůstává kultivace. Existuje speciální médium pro druh Bordetella pertussis a speciální způsob očkování na tuto půdu. Na rozdíl od mnoha jiných bakterií je Bordetella rezistentní k penicilinu. Proto začínáme kápnutím kapky penicilinového roztoku doprostřed misky s agarem. Výtěr je smíchán s kapkou a očkován ve směru spirály. Poté jsou očkovány radiální paprsky kličkou. Napište název půdy a zakreslete postup očkování podle obrázku. Název půdy: ____________________ b) Demonstrace kultivační půdy na legionely Prohlédněte si kultivační půdu na legionely. Zapište o ní několik údajů. Zkratka Co znamenají jednotlivá písmena ve zkratce Barva půdy c) Průkaz protilátek proti tularémii Studenti zubního lékařství tento úkol neprovádějí d) Diagnostika protilátek proti brucelóze Diagnostika brucelózy (Bangova choroba – způsobena B. abortus) byla provedena nepřímým průkazem – metodou ELISA ve třídách IgG i IgM. Absorbance byla změřena spektrofotometrem a výsledky byly expertním systémem přímo vyhodnoceny jako „pozitivní“, „hraniční“ či „negativní“. Výsledky najdete na stole. Pokuste se o konečný závěr k jednotlivým pacientům. Pacient Výsledek IgM Výsledek IgG Konečný závěr Alice Bob Claudia David Poznámka: Brucelóza je vzácnou nemocí, pročež řada laboratoří včetně té naší diagnostiku neprovádí. Z tohoto důvodu pracovní listy použité pro tento úkol nejsou skutečné, ale jsou to upravené pracovní listy z jiné serologické reakce. Nicméně skutečné pracovní listy pro diagnostiku brucel by vypadaly stejně či velmi podobně.