NA STOPĚ PACHATELE Díl čtrnáctý: Opakování Mikrobiologický ústav uvádí L Autor prezentace: Ondřej Zahradníček (kontakt: zahradnicek@fnusa.cz). K praktickému cvičení pro Bi7170c Základní informace •Student si vytáhne jeden z 60 úkolů; není řečeno, že jsou vždy všechny k dispozici •Ke každému z praktik jarního a podzimního semestru přináleží cca dva až čtyři úkoly. Některé úkoly náležejí k více praktikům (např. ASLO k neutralizaci i ke streptokokům) •Některé části praktik jsou sice mimo úkoly, nicméně studenti na ně mohou být tázáni •Studenti mohou být žádáni o písemné vypracování úkolu formou protokolu (ne nutně vždy) Přehled témat [USEMAP] [USEMAP] [USEMAP] Metody J01 Mikroskopie •Nativní preparát – pro velké a/nebo pohyblivé mikroby (parazity, houby, pohyblivé mikroby) –Znát také: Zástin (hlavně spirochety) •Gramovo barvení – jak se dělá + přehled dalších barvicích metod (Giemsa, Ziehl Neelsen, Burri…) •Prohlížení již nabarvených preparátů – hlavně interpretace •Mikroskopické jsou i některé úkoly z jiných témat! Příprava nativního preparátu •V případě nativního preparátu kapku, ve které je vzorek či rozmíchaný kmen, nesušíme. Pouze přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme objektivy, které zvětšují např. 4 ×, 10 × či 40 ×. •Nepoužíváme imerzní olej •Pozor! Kdo namočí neimerzní objektiv do imerzního oleje, okamžitě končí a u zkoušky neuspěl!!! Nativní preparát – postup (u kmene) Nativní preparát Jednoduché barvení Příprava barvených preparátů 7a: voda Gramovo barvení – postup •Genciánová violeť = Sol. Gram-Nowy (20 –) 30 vteřin •Lugol (20 –) 30 vteřin •Alkohol 15 (– 20) vteřin •opláchnout vodou – nezbytné!!! •Safranin 60 – 120 vteřin •opláchnout vodou •osušit sušítkem* z filtračního papíru •mikroskopovat jako v prvním úkolu Dift1 P1010003 Mikroskopie vzorku Mikroskopie kmene Foto O. Z. Co ještě vědět •Kromě zhotovení nativního preparátu a Gramem barveného preparátu se po vás také může chtít odečíst již několik hotových sklíček (nátěry ze vzorků). •Zde se očekávají také vaše znalosti z pozdějších praktik (např. interpretace nálezu leukocytů ve sputu a obecně v klinickém materiálu, nález intraleukocytárních diplokoků v uretrálních výtěrech apod.) J02: Kultivace Přeočkování agarové kultury Rozočkování Vyžíhejte kličku Naberte kmen Naočkujte první úsek Vyžíhejte kličku Už znovu nenabírejte kmen Naočkujte druhý úsek Vyžíhejte kličku Už znovu nenabírejte kmen Naočkujte třetí úsek Vyžíhejte kličku Už znovu nenabírejte kmen Naočkujte „hádka“ Pozor! •Úkol je těžší, než se zdá (zapomíná se na vyžíhání mezi jednotlivými kroky, nebo se zapomene na to, že čáry se musí křížit) •Naopak se nehodnotí technická dokonalost čar (je nám jasné, že nejste zkušení mikrobiologové ani laboranti) •Jde tedy o pochopení (a případně i vysvětlení) principu křížového roztěru Další pod-téma: vysvětlete funkci daných kultivačních půd •1. bujon •2. VL-bujon •3. selenitový bujon •4. Sabouraud •5. Löwenstein-Jenssen •6. KA •7. Endo •8. MH •9. NaCl •10. VLA •11. XLD (a MAL) •12. ČA •13. Levinthal •14. Slanetz-Bartley S některými dalšími půdami se případně můžete u praktické zkoušky setkat také, ale spíše výjimečně a u jiných úkolů (speciální bakteriologie) J03: biochemická identifikace •V rámci jiných úkolů (speciální bakteriologie a mykologie) určitě musíte být schopni provést: –Katalázový test a testy s diagnostickými proužky (oxidáza, INAC, PYR) + znát kdy který použít –Hajnovu půdu použít k odlišení nefermentujících od fermentujících tyčinek; další přesné vlastnosti Hajnovy půdy a MIU se nepožadují, i když jejich znalost není na škodu •Jediný úkol čistě patřící k J03 je –odečtení biochemického testu typu ENTEROtest (dostanete vše potřebné a test odečtete; nic více, ale také nic méně; důležité je určit i procento pravděpodobnosti a index typičnosti) Nezapomeňte na ONPG musí se odečíst před ostatními testy 1 2 H 3G 4 F 5 E 6 D 7 C 8 B 9 A 10 H 11 G 12 F 13 E 14 D 15 C 16 B 17 A První řádek panelu Druhý řádek panelu + S l l l l l l l l l l l l l l l l – S l l l l l l l l l l l l l l l l ? S l l l l l l l l l l l l l l l l ? + – + + + – – – – – – – – + + + + 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 5 3 0 0 6 3 J04: PCR a jiné průkazy DNA/RNA •Není nutno znát detaily principu, ale je potřeba vědět, kdy a jak se používají v mikrobiologii •Tyto metody používáme zpravidla tam, kde mikroskopický a kultivační průkaz je obtížný nebo není vůbec možný •Nehodí se příliš pro běžné patogeny přítomné ubikvitárně. Pro svou velkou citlivost by ruče vyčenichaly kdejakou molekulu přilétlou z vnějšího prostředí •Metody nejsou ani neužitečné, jak si někdo myslí, ani samospasitelné, jak si myslí pro změnu jiní Nutno znát interpretaci PCR Vlastní reakce Interní kontrola Interpretace negativní pozitivní negativní negativní negativní inhibice reakce pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní negativní (vysoce) pozitivní pcrtbc upravený Třeba Pacienti 1 a 4 – pozitivní, pacient 2 – negativní, pacient 3 – inhibice reakce. 5 – pozitivní kontrola, 6 – negativní kontrola, 7 – ladder ß Vlastní reakce ß IC J05 Dekontaminační metody •Nutná znalost metodologického rozdílu •Pokud chceme ověřit mez přežití bakterií, musíme je po odstranění testovaných extrémních parametrů přemístit do podmínek růstového optima a nechat je tam dostatečně dlouho. •V opačném případě bychom ověřili pouze mez růstu, nikoli mez přežití. Úkol: Vyhodnocení účinnosti desinfekce •Nestačí jen říci, kolikaprocentní desinfekce je výsledkem testu, je také potřeba říci (a zdůvodnit!) že jde o baktericidní, nikoli bakteriostatickou koncentraci desinfekce. •(V agaru, na kterém se bakterie pěstuje, už žádná desinfekce není.) Parametry sterilizace Vyhodnocení účinnosti horkovzdušné sterilizace Rezistentní, sporulující bakterie 160 °C 170 °C 180 °C 20 min přežívá přežívá hyne 30 min přežívá hyne hyne 60 min hyne hyne hyne K oběma úkolům navíc •patří vytvoření dvojic z předložených lístečků (například spárovat „sterilizace kovu, který nesnese vlhké teplo“ a „horkovzdušná sterilizace“) •lístečky jsou v praktikárně k dispozici J06: Antimikrobiální látky Nutná znalost kvalitativních i kvantitativních testů atbpsae21 Foto: MiÚ Není samostatným úkolem, ale je součástí úkolů ze speciální mikrobiologie Mikrodiluční test – odečtení •Včetně porovnání s breakpointy a vysvětlení interpretace P3160025ux Někdy se v důlcích mohou objevit bublinky – při odečítání si jich nevšímejte E-test – není samostatným úkolem, ale znát byste ho měli •Hodnota MIC se odečítá přímo na proužku – v.místě, kde okraj zóny protíná daný proužek etest etest www.uniklinik-ulm.de Betalaktamázy běžné i širokospektré I395 I395a Mohou být také součástí některého úkolu Foto O. Z. J07 Biofilm Porovnání metod kultivace cévních katetrů •Klasická kultivace v bujónu •Makiho semikvantitativní metoda •Sonifikace (rovněž semikvantitativní! •Odečtení + diskuse: výhody a nevýhody všech metod, možná interpretace J07 Biofilm: Úkol posouzení vlivu sacharidů a času na biofilm •Jako v praktiku, ale včetně vytvoření grafu •Posuďte vliv příjmu různého množství sacharidů ve stravě na rychlost tvorby biofilmu u kariogenního Streptococcus mutans. •Jaké závěry vyplývají z tohoto pokusu ohledně množství sacharidů ve stravě, délce jejich setrvání v dutině ústní apod.? Schema důlků Seropanl biofilm •Zatímco MIC je metoda určující minimální •inhibiční koncentraci ATB u planktonické formy, •MBEC zjistí eradikaci bakteriálního biofilmu. •Vypovídá tedy lépe o skutečném účinku antibiotika •na bakterie žijící ve formě biofilmu. •MBEC odpovídá nejnižší koncentraci antibiotika, kde ještě prokážeme eradikaci biofilmu (nepřítomnost živých buněk, nedochází ke změně pH média, důlek tedy zůstává červený) Další úkol – stanovení MBEC 1 Foto: Archiv Veroniky Holé Serologie – praktika J08 až J10 Průkaz antigenu: laboratorní protilátky (zvířecího původu)+ vzorek pacienta nebo kmen mikroba. Přímá metoda Průkaz protilátky: laboratorní antigen (mikrobiální) + sérum (výjimečně sliny, likvor) pacienta Nepřímá metoda Antigen a protilátka II Antigen a protilátka I Interpretace – důležité znát! •Průkaz antigenu je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v těle pacienta •Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: –Množství protilátek (relativní – titr) a jeho změny v čase (dynamika titru) –Třída protilátek: IgM/IgG (pouze u reakcí se značenými složkami!) –(Avidita protilátek) Precipitace Precipitace Dva příklady precipitace •1) Tzv. mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho – není přímo úkolem, ale může na ni přijít řeč + - - - 2) RRR – vyvločkovací (flokulační) reakce s kardiolipinem na syfilis Aglutinace Aglutinace Agglutinace k detekci antigenu nebo antigenní analýze •Průkaz EPEC: v jaké situaci se dělá, jak se dělá (prakticky – dostanete kmen a měli byste vědět, co s ním) •Aglutinace likvoru (úkol „Okomentujte video“). Důležité: tato metoda je vedle mikroskopie druhou rychlou metodou průkazu purulentní meningitidy Aglutinační reakce k průkazu protilátek •K+ pozitivní, titr = 1 : 200 •Č. 1 negativní •Č. 2 pozitivní, tit. = 1 : 400 •Č. 3 negativní •Č. 4 pozitivní, titr = 1 : 200 1:100 1:200 1:400 1:800 Aglutinace na nosičích Aglutinace na nosičích Příklad: TPHA TPHA detail +++ ++ + +/- - - - - Komplementfixace C:\Uživatel\Ondra\Pracovní věci\Výuka\Výukové materiály\Medici\KFR.JPG Test antikomplementarity C:\Uživatel\Ondra\Pracovní věci\Výuka\Výukové materiály\Medici\KFR antikomplementarita.JPG Toto je méně důležité Neutralizace •Protilátka (Ig) brání efektu toxinu/viru na buňku / krvinku C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Červená Karkulka bez protilátky.bmp C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Červená Karkulka s protilátkou.bmp Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Toxin či virus Toxin či virus Protilátka + – Buňka ve tkáňové kultuře či červená krvinka Příklady neutralizačních reakcí Neutralizován Objekt Reakce Toxin bakterie (hemolyzin) Erytrocyt hemolýza ASLO Virus Erytrocyt shlukování HIT Virus Buňka efekt metabolický VNT Pozor – ASLO a co o něm znát •Po každé streptokokové infekci se objevují protilátky, často včetně protilátek proti streptokokovému toxinu – streptolyzinu O. •Někdy se však stane, že množství těchto protilátek po infekci neklesá, naopak stoupá. Protilátky se totiž vážou na některé struktury hostitelského organismu (autoimunita), roztáčejíce „bludný kruh“. •V takovém případě jsou tedy paradoxně nebezpečnější protilátky než patogen, proti kterému nás měly chránit. HIT •Hemaglutinačně Inhibiční Test: Dávejte pozor, toto NENÍ aglutinační, ale neutralizační reakce! Protilátky neutralizují virové shlukování erytrocytů. •A tak: Bramboroid = negativní výsledek. Intenzivní kulatá tečka = pozitivní výsledek •HIT se liší od ASLO hlavně tím, že krvinky nejsou hemolyzované, ale shlukované. Ovšem to, že specifické protilátky blokují akci platí v obou případech Reakce se značenými složkami Laboratorní protilátka Hledaný antigen Antigen chybí Značená laboratorní protilátka (àdetekce) Značená laboratorní protilátka + – Není navázaná je odplavena nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii) Pacientův vzorek Laboratorní protilátka ELISA – příklad (MiÚ) ELISA pro průkaz protilátek. Klikni! Jeden úkol: skládačka HBsAg / anti-HBS •Testování HBsAg – pozitivní •Testování HBsAg – negativní •Testování anti-HBs – pozitivní •Testování anti-HBs – negativní Například umět vyhodnotit BL 4 BL 4 K- 5 K- 5 K- 6 K- 6 K+ 7 K+ 7 K+ 8 K+ 8 1 9 1 9 2 10 2 10 3 11 3 11 c. o. (IgA) = (0,107 + 0,137)/2 + 0,320 c. o. (IgA) = 0,122 + 0,320 = 0,442 90 % c. o. = 0,398 110 % c. o. = 0,486 hodnoty pod 0,398 jsou negativní hodnoty nad 0,486 jsou pozitivní c. o. (IgG) = (0,034 + 0,029)/2 + 0,320 c. o. (IgG) = 0,032 + 0,320 = 0,352 90 % c. o. = 0,317 110 % c. o. = 0,387 hodnoty pod 0,317 jsou negativní hodnoty nad 0,387 jsou pozitivní HLEDEJTE POZITIVNÍ A HRANIČNÍ PACIENTY JAK V IgA, TAK I V IgG! IgA IgG Western blotting – princip •1: původní antigen (směs) •2: uvolnění jednotlivých antigenů detergentem •3: elektroforetické rozdělení antigenů •4: „přesátí“ rozdělených antigenů na nitrocelulózu •5: reakce ELISA (přítomny jsou jen některé protilátky) C:\Uživatel\Ondra\Obrázky a fotky\Odborné\Kreslené\Western blotting.bmp Western blot – vzhled (obrázek z Foto: MiÚ) Western blot. Klikni! Immunochromatografie + – Test area Control area Důležité! •Je potřeba nejen vědět, jak vyhodnotit test, ale také jak ho interpretovat. •Existují tři speciální úkoly (na toxoplasmózu, boreliózu a hepatitidy A/B/C) založené na komplexní interpretaci včetně anamnézy! –Např. těhotná žena s IgG proti toxoplasmóze NENÍ nemocná, ale chráněná! [USEMAP] Speciální lékařská mikrobiologie J11+J12 Virologie •Větší část virologie je totožná se serologií (průkaz HBsAg a podobně) •Navíc: přímý průkaz viru na vaječných zárodcích a buněčných kulturách (a na sajících myšatech, teoreticky) •Nutno znát: kdy je a kdy není vidět výsledek izolace viru, a co se dá dělat, když výsledek vidět není (hemaglutinace, hemadsorpce) Nutno znát části oplodněného vejce… 01 Schéma vajíčka AM – amniový vak, YS – žloutkový vak, AL – allantois CH – chorioallantoidní membrána (CAM) SH – skořápková (papírová) membrána AB – bílek http://www.scielo.cl/fbpe/img/bres/v38n4/fig02.gif 01 slide05 10 MLEC www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html http://cmir.mgh.harvard.edu/cellbio/cellculture.php?menuID_=122 (HSV je virus prostého oparu – HSV 1 způsobuje zpravidla herpes labialis, HSV 2 herpes genitalis) Takže tady CPE je… ...a tady není …a zhruba tušit něco o CPE J13: Parazitologie. Znát tato vejce: •Alespoň tyto tvary byste měli znát ke zkoušce eggs Škrkavka Tenkohlavec bičíkový taenia1 Roup Mrľa Enterobius Škrkavka Hlísta Ascaris Tenkohlavec Trichuris Tasemnice Pásomnica Taenia + články! Obrázky převzaty z CD-ROM „Parasite-Tutor“ – Department of Laboratory Medicine, University of Washington, Seatle, WA Znát metody diagnostiky střevních parazitů •Jako základ se používají metody, které představují v podstatě nativní preparát v různých modifikacích –U metody dle Kato se používá dobarvení pozadí malachitovou zelení, aby se paraziti zvýraznili –Faustova metoda je koncentrační (viz dále) •Grahamova metoda se používá jen u roupů (umět odečíst i prakticky) •Nativní preparát „sensu stricto“ a barvené preparáty (např. trichromem) se použijí u zvýšeného podezření na střevní prvoky (buďto primárně, nebo po prohlédnutí Fausta a Kato) Pozor – také dg. Toxoplasma gondii serologickými testy •Jak již bylo řečeno, u tkáňových parazitů se často používá nepřímý průkaz •KFR. První důlek je test antikomplementarity séra , ve druhém ředění 1 : 5, dále geometrickou řadou (1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80 atd.). Pozitivní je nepřítomnost hemolýzy, negativní je hemolýza •ELISA – způsob výpočtu: co je vyšší než (C1+ D1) : 2, je pozitivní. A1 je blank, B1 negativní, E1 pozitivní kontrola. J14 mykologie •Kvasinky se zkoušejí se jako bakterie z P01 až P06 – vizte dále •U vláknitých hub se předpokládá, že určíte houbu podle mikroskopického preparátu porovnáním s obrázky hub, které se prohlížely v praktiku Důlek s antigenem pozitivní P01 až P06 a J13 (většina speciální bakteriologie a kvasinky) •Jednotný typ úkolů: „Z předložených kmenů vyberte kmen … (např. stafylokoka), blíže určete, popř. také určete test citlivosti na antibiotika“ •Úkol z větší části teoretický (Gramovo barvení se nedělá, jen se o něm hovoří), ale některé části (kataláza, oxidáza) se mohou provést i prakticky, je-li na to čas •Důležité je znát a dodržet algoritmus – postupovat od obecného k detailnímu Výjimky: •ASLO se zkouší jako serologický úkol, plus znalost specifického významu tohoto testu (viz u serologie) •Grampozitivní tyčinky se zkoušejí jinak – student si prohlíží obrázky G+ tyčinek a má určit, který obrázek morfologicky odpovídá korynebakteriím, plus odpoví na doplňující otázky (např. „co by to mohlo být, kdyby to nedělalo palisády a rostlo by to při 4 °C?“) •Zvláštní úkoly se také týkají anaerobů, mykobakterií a spirochet Korynebakteria, tvary diftmik2 diftmik2a foto O. Z. P07: Anaeroby popis anaerostatu Anae3 vzduchotěsné víčko palladiový kalalyzátor (pod víčkem) konstrukce pro ukládání Petriho misek Generátor anaerobiózy (sáček s chemikáliemi) šroubovací uzávěr tlakový ventil foto O. Z. Anae1 Foto: MiÚ, photo O. Z. Detekce lecitinázy nProdukce lecitinázy je detekována jako precipitace kmene na žloutkovém agaru. Existuje ovšem mnoho lecitináz, a zajímá nás pouze lecitináza Clostridium perfringens, musíme tedy ověřit, bude-li lecitináze inhibována příslušným antitoxinem „Negativní I“ vůbec neprodukuje lecitinázu. „Negativní II“ produkuje, ale nějakou jinou, než nás zajímá Lecitináza Plus: znát i další metody, znát půdy pro anaerobní kultivaci aj. •Pokus na zvířeti se používá u tetanu a botulismu. U tetanu se myš svíjí v křeči, u botulismu jsou naopak patrné parézy. U toxinu Clostridium perfringens se pokus na zvířeti nepoužívá, zde využíváme kultivační průkaz lecitinázy na žloutkovém agaru. U toxinu Clostridium difficile využíváme imunochromatografický test. P08: Acidorezistentní bakterie Znát Ziehl-Neelsena •V prvním kroku barvíme karbolfuchsinem (Gabbetem) za horka až do výstupu par. Bez zahřívání by mykobakteria nešlo obarvit, leda při použití koncentrovanějšího karbolfuchsinu. •V druhém kroku odbarvujeme cca 15 s „kyselým alkoholem“, což je směs alkoholu s minerální kyselinou, nejčastěji kyselinou chlorovodíkovou, poté opláchneme vodou •Ve třetím kroku dobarvujeme pozadí, tj. vše, co jsme ve druhém kroku odbarvili. Dobarvujeme cca 30 s malachitovou zelení nebo metylenovou modří. Opět opláchneme, osušíme a pozorujeme imerzí. •Výsledkem jsou červené acidorezistentní tyčinky na modrém nebo zeleném pozadí Jak se zkouší •Měli byste znát postup, plus vědět, jak vypadá pozitivní Ziehl-Neelsen a na základě toho umět odlišit jeho obrázek od jiných (například Gramem barvených preparátů) •Plus (stejně jako u dalšího úkolu) znalost ostatních metod u TBC, testování citlivosti, diagnostika aktinomycet a nokardií (rámcově) pro dodatečné dotazy Další úkol: Kultivace mykobakterií •Vědět,že před kultivací musí být provedeno moření •Znát půdy (Šula, Banič a vaječné půdy Ogawovu či Löwenstein-Jenssenovu). •I pevné půdy se nalévají do zkumavek a uzavírají zátkou. Není to jen kvůli ohrožení personálu, ale především kvůli vyschnutí půdy. •Výsledky se odečítají po 1 (kontrola kontaminace) 3, 6 a pro jistotu i 9 týdnech kultivace. (Pozitivní výsledky se obvykle nacházejí po šesti týdnech) •Buněčná imunita •Testování kvantiferonu včetně pochopení významu zkumavek „NIL“ a „MIT“ •Vysvětlení významu nepřímé diagnostiky TBC Nepřímá diagnostika TBC P09 Serologie syfilis + serologie borreliózy (viz serologická část) Historický BWR – Bordet Wassermann Netr. Screeningové RRR – Rapid Reagin Test TPHA/TPPA Treponemové Konfirmační ELISA FTA-ABS (nepř. imunofluor.) Western Blotting Historický, popř. superkonfirmace TPIT (Treponema Pallidum Imobilizační Test) = Nelson [USEMAP] Rámcově musíte znát také testy přímého průkazu! Klinická mikrobiologie „sensu stricto“ •Odběry a rozhodování obecně (P10): •Několik úkolů, všechny jsou stejné: •„Pro tři minikazuistiky najděte vhodné metody odběru a nádobky/výtěrovky pro odběr •Je nutná znalost odběrových souprav (požaduje se, abyste prakticky ukázali vhodnou soupravu) P10–13 Klinická mikrobiologie I–IV Některé typy výtěrovek 11 Abstrichbesteck-MEDI_SWAB Amiesova půda s aktivním uhlím www.herenz.de Univerzální transportní půda pro bakteriologii (všechny typy výtěrovek). Drátěná varianta je důležitá, pokud se potřebujeme „dostat za roh“. Suchý tampon www.calgarylabservices.com Dnes se používá jen pro PCR a průkaz antigenu, ne pro kultivaci! 12 PlainSwab Další výtěry 17 virus swab Na viry www.copanswabs.com 18 chlamydia swab Na chlamydie www.copanswabs.com Fungi Quick (na kvasinky a plísně) www.copanswabs.com Souprava C. A. T. (Candida And Trichomonas, pouze z genitálií www.copanswabs.com P1010011čb P1010011čb Nádobky Zkumavka sérová čb otočená bez popisu Sputovka čb otočená bez popisu Na střevní parazity čb otočený bez popisu Do toho se vychčije čb Běžná zkumavka. Universální použití: srážlivá krev (serologie), moč, likvor, hnis, punktát apod.; krevní a močové katetry, menší kousky tkání… Sputovka. Nejen na sputum, ale např. i na větší kousky tkání Nádobka na stolice – na parazitologii. Pouze tato nemusí být sterilní! Nádobka na odběr moče. Je lepší, když pacient čurá rovnou do zkumavky, avšak zvláště pro ženy je to obtížné (nejsou-li ve sprše). Mohou tedy močit do této nádobky, a pak sestra moč přelije do zkumavky. P11–13 Klinická mikrobiologie II–IV •Zahrnuje řadu zrádných úkolů: •Najít patogeny mezi běžnou orofaryngeální mikroflórou (nutno vědět, která to je, a jak se tam patogeny hledají) •Odečíst semikvantitativní a kvalitativní vyšetření moče – nezapomenout, že určení kvantity je podmínka nutná, ale nikoli dostačující (je totiž ještě nutno zjistit, co to je za mikroba) •Odečíst hemokulturu (mikroskopicky i kultivačně), poševní nátěr a výtěr, výtěr z rány, výtěr z řiti Záchyt patogena v krku či sputu Očkování výtěrů 1 očkováno tamponem 2 očkováno kličkou 3 stafylokoková čára 4 disk BH (bacitracin pro hemofily) 5 disk VK (vankomycin a kolistin pro meningokoky) Na celé naočkované ploše pátráme po streptokocích (bezbarvé) a po stafylokocích (spíše bílé či zlatavé) Kultivační výsledek výtěru z krku s běžnou flórou Klin7 Klin9a V těchto místech pátráme po hemofilech Foto: MiÚ Den 0. (přijatá stolice) •Negativní výsledek je za 48h •Pozitivní za 72h a déle selenit 24 h 48 h identifikace Endo Endo XLD MAL MCs KA NaCl CCDA CIN + 72hod 42°C 28°C *Není-li uvedeno jinak, kultivace probíhá při 37 °C Kultivace stolice Selenit, XLD, MAL – na salmonely CIN – na yersinie CCDA – na kampylobaktery NaCl – na stafylokoky MCS – na některé STEC Endo – na různé enterobakterie KA – na některé další bakterie vždy jen někdy Semikvantitativní zpracování moče •Používá se kalibrovaná plastová klička – do očka kličky se zachytí vždy 1 µl moče •Tento mikrolitr se rozočkuje většinou na polovinu misky krevního agaru (vy to máte na celé misce) •Kolonie není třeba přesně spočítat, stačí odhadnout je-li jich více než 100, méně než 10 nebo „něco mezi“ •Zároveň je třeba určit patogena, který se v moči nachází Semikvantitativní hodnocení moče Počet kolonií na misce Počet CFU (bakterií) v 1 µl moče Počet CFU (bakterií) v 1 ml moče Hodnocení (platí pro 1 druh bakt.) Méně než 10 Méně než 10 Méně než 104 Kontaminace 10–100 10–100 104–105 Hraniční Více než 100 Více než 100 Více než 105 Infekce Výpočet Nugentova skóre •Vzhledem k tomu, že jde o mikroskopický a ne kultivační průkaz, pracuje systém s tzv. morfotypy. Například bakterie patřící k „morfotypu laktobacil“ nemusí být laktobacil, ale je to velmi pravděpodobné. •Morfotyp Gardnerella/Bacteroides: nepřítomny = žádný bod, + = jeden bod, ++ = dva body, +++ = tři body, ++++ = čtyři body •Morfotyp Lactobacillus: naopak – nepřítomny = čtyři body až pozitivita na ++++ = nula bodů •Zahnuté gramlabilní tyčinky: nejsou = 0 bodů, + či ++ = jeden bod, +++ či ++++ = dva body Poševní výtěry •Poševní výtěry zpravidla kultivujeme na následujících půdách: •• krevní agar (na běžné bakteriální patogeny) •• Endova půda (nebo McConkeyho půda) •• agar s 10 % NaCl (pro staphylokoky) •• speciální varianta krevního agaru pro Gardnerella vaginalis (GVA agar) •• WCHA agar (anaerobní kultivace) – jen někdy Stěr a otisk obr[1] Obrázky otiskové metody převzaty z prezentace MUDr. Zdeňka Chovance z I. CHK LF MU a FN USA v Brně Výtěr z rány (bez anaerobní kultivace): Možné diagnostické schéma •(Podle okolností se může v praxi lišit) lDen 0: pouze nasazení kultivací lDen 1: výsledek primokultivace vzorku na krevním agaru (KA), Endově půdě, KA s 10 % NaCl a KA s amikacinem. V případě negativity všech pevných půd se prohlíží bujón, je-li zakalený, vyočkuje se (subkultivace) lDen 2: expedice všech negativních a mnohých pozitivních výsledků – pro komplikace, rezistence apod. ovšem zdaleka ne všech lDen 3: expedice dalších pozitivních výsledků Hemokultury – odběr krve •Jedná se o nesrážlivou krev, principiálně zcela odlišné vyšetření než vyšetření serologická (nejde o průkaz protilátky ani antigenu, mikrob musí zůstat živý a prokazuje se kultivačně) •Dnes zpravidla odběr do speciálních lahviček s transportně-kultivačním médiem pro automatickou kultivaci (kdysi se posílala jen samotná nesrážlivá krev) •Nutno zabezpečit tak, aby se minimalizovalo riziko pseudobakteriémie (viz dále) •U dospělých se odebírá 10 až 20 ml krve, u dětí zpravidla 1–5 ml podle věku (odběr je u nich náročnější než u dospělých, a také platí, že u dětí má význam i méně bakterií) Fungování kultivátorů •Kultivátor, napojený na počítač, automatický udržuje optimální podmínky kultivace, a zároveň vyhodnocuje stav nádobky a indikuje případný růst (např. změna reflektance, tj. optických vlastností lahvičky) •Růst je zvukově a opticky signalizován. Pokud ani po týdnu nic neroste, signalizuje to přístroj také (je třeba expedovat negativní výsledek) Nashledanou u zkoušky! kresba: Petr Ondrovčík SAU-maluvka [USEMAP]