67
SEDIMENTACE ČERVENÝCH
KRVINEK (SUSPENZNÍ STABILITA
KRVE)
Klíčová slova
Sedimentace, suspenzní stabilita krve, suspenze, Helmholtzova elektrická dvojvrstva, FW, SE, šikmá
sedimentace, faktory ovlivňující sedimentaci, nesrážlivá krev.
Pracovní část
Potřeby
Stojan se sedimentačními pipetami, sada pro určení sedimentace (plná lidská krev, lidská krev – plazma
nahrazena fyziologickým roztokem), plná hovězí krev, plná koňská krev, koňská krev – nahrazená plazma
fyziologickým roztokem).
Postup práce
1. Pomocí kapátka doplníme do zkumavka přibližně 2 ml krve (po černou rysku); každý vzorek má svoji
zkumavku i svoje kapátko.
Striktní zásada pro práci s krví: pracujeme pouze v gumových rukavicích!
68
2. Levou rukou uchopíme naplněnou zkumavku a pravou rukou pipetku mírným tlakem zasuneme kolmo
dovnitř zkumavky (kalíšku)s krví. Vytvoří se tak podltlak.
3. Při správném postupu sloupec krve postupně vystoupá po značku 0. Zkumavku „zacvakneme“ do
příslušného stojanu.
4. V časových intervalech odečítáme v milimetrech rychlost sedimentace krevního sloupce erytrocytů,
zapíšeme do grafu v protokolu.
Obrázek 12-1 Je velice důležité promíchat každou krev těsně před použitím. Zvláště koňská krev
sedimentuje velice rychle, a proto při nedostatečném zamíchání by docházelo k hodnocení v podstatě
pouze plazmy. Krev míchejte pomalými krouživými pohyby, v opačném případě dojde ke vzniku směsi
krve a vzduchu, která ovlivní průběh pokusu.
Obrázek 12-2 Správné nasátí krve do Westergrenovy pipety.
Komentář: Automatickou pipetu přitlačíme ke kalíšku se vzorkem tak, aby vznikl v kalíšku přetlak. Při
plnění kalíšku je potřeba věnovat pozornost zvláště vhodnému množství krve. Při přeplnění kalíšku může
dojít po vsunutí pipety k vylití vzorku.
69
Hodnocení a výsledky
Tabulka 12-1 Zapište typy hodnocené krve a sedimentaci v mm po uplynutí dané doby.
Vzorky
Čas
…………….. …………….. …………….. …………….. ……………..
15 minut
30 minut
45 minut
60 minut
Tabulka 12-2 Fyziologické hodnoty sedimentací po odečtu nejméně 1 h.
Typ Sedimentace
Muži: 2 - 8 mm/h
Ženy: 7 - 12 mm/h
Novorozenci: 2 mm/h
Kojenci: 4 - 8 mm/h
70
Závěr
Popište rozdílné průběhy sedimentací a zdůvodněte příčinu.
71
OSMOTICKÁ REZISTENCE
ERYTROCYTŮ
Klíčová slova
Osmotický tlak, izotonicita, hypotonicita, hypertonicita, hemolýza.
Pracovní část
Potřeby
stojan s 13 zkumavkami, nesrážlivá krev, destilovaná voda, fyziologický roztok, 1 % roztok NaCl, 0,9 % NaCl,
kapátko, 2 pipety, emitní miska.
Postup práce
1. Do 12 zkumavek napipetujte 1 % roztok NaCl v následujících množstvích: 6,3; 6,0; 5,7; 5,4; 5,1; 4,8; 4,5;
4,2; 3,9; 3,6; 3,3; 3,0 ml.
2. Doplňte zkumavky destilovanou vodou do celkového objemu 10 ml.
3. Do 13. zkumavky napipetujte 10 ml fyziologického roztoku (0,9 %NaCl).
4. Zkumavky s roztoky mírně zamíchejte.
5. Krev v lahvičce opatrně promíchejte a pomocí kapátka do každé zkumavky kápněte 2 kapky krve.
Zkumavky palcem v rukavici uzavřete, pomalu překlopte a vraťte do původní polohy (opravdu pomalu,
nechceme vytvořit fyzilkální hemolýzu). Nechejte minimálně 30 minut reagovat.
6. Po daném čase subjektivně stanovte přítomnost hemolýzy. Jako kontrolu použijte zkumavku
s fyziologickým roztokem.
Hodnocení a výsledky
Zakreslete do zkumavek stav hemolýzy - Tabulka 13-1).
• Nepřítomnost hemolýzy: Nehemolyzované erytrocyty tvoří neprůhlednou suspenzi. Nad touto
suspenzí v důsledku sedimentačního efektu se nachází tenká čirá do žluta zbarvená vrstva čisté
plazmy
• Částečná hemolýza: Hemolyzované erytrocyty mění barvu vrstvy plazmy ze žluté na jemně
růžovou. Její intenzita závisí od úrovně hemolýzy v roztoku
• Úplná hemolýza: Zkumavka obsahuje průhledný, rovnoměrně růžově zabarvený roztok. Není
patrná žádný zákal na dně zkumavky.
72
Určení minimální, maximální rezistence a rezistentní šíře
• Minimální osmotická rezistence: Odečítá se na první zkumavce s načervenalým zbarvením plazmy
nad neprůhledným sedimentem. V této zkumavce dochází k hemolýze nejméně odolných
erytrocytů.
• Maximální osmotická rezistence: Odečítá se na poslední zkumavce se zákalem u dna. Ten je tvořen
nejvíce odolnými erytrocyty.
• Osmotická rezistentní šíře: Jedná se o rozmezí mezi hodnotou minimální a maximální osmotické
rezistence.
Obrázek 13-1 Stav hemolýzy ve zkumavkách.
Komentář: Vlevo nepřítomná hemolýza. Uprostřed částečná hemolýza. Vpravo úplná hemolýza. Tip:
Položte za zkumavky list s textem a sledujte, zda lze přes zkumavku text číst. Pokud ano, znamená
to, že v této zkumavce již probíhá hemolýza (nejčitelnější text je ve zkumavce s úplnou hemolýzou,
žádné membrány odolných erytrocytů nebrání viditelnosti textu).
73
Tabulka 13-1 Zaneste do tabulky přítomnost hemolýzy v jednotlivých zkumavkách
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Koncentrace
Roztoku NaCl
[%]
0,63 0,6 0,57 0,54 0,51 0,48 0,45 0,42 0,39 0,39 0,33 0,3 0,9
Přítomnost
hemolýzy
[ANO/NE]
74
Závěr
Shrňte všechny naměřené výsledky a stručně popište fyziologické jevy, které se s nimi pojí. Popište, zda
naměřené hodnoty byly ve fyziologickém rozmezí. Jaké nemoci jsou spojeny se zvýšenými nebo sníženými
hodnotami osmotické rezistence?
75
STANOVENÍ POČTU ERYTROCYTŮ
Klíčová slova
Erytrocyty, leukocyty, trombocyty, diferenciální počet, retikulocyty, anémie, erytrocytopenie, polyglobulie,
hematokrit, icterus neonatorum.
Pracovní část
Potřeby
Bürkerova komůrka, krycí sklíčko, mikroskop, banička se zátkou, dávkovací mikropipety, kapátko s jemným
hrotem, Hayemův roztok, emitní miska.
Postup práce
1. Nasaďte si rukavice a odměřte mikropipetou 4950 µl Hayemova roztoku. Roztok aplikujte do připravené
baňky. Použitou špičku z mikropipety odstraňte do emitní misky. Uzavřete Hayemův roztok a odložte.
2. Krouživými pohyby opatrně promíchejte nádobu s krví tak, aby se erytrocyty v kapalině rovnoměrně
rozložili. Pomocí druhé mikropipety přeneste 25 µl krve do baňky s Hayemovým roztokem. Použitou
špičku z mikropipety odstraňte do emitní misky, uzavřete nádobu s krví a odložte.
3. Baňku s Hayemovým roztokem a krví uzavřete a krouživými pohyby promíchejte její obsah (důvodem
je snaha předejít vzniku bublin). Dbejte na to, aby se roztok nedostal do kontaktu se zátkou baňky.
4. Nachystejte si Bürkerovu komůrku. Ta obsahuje pohyblivá ramena a aretační šroubky, pomocí kterých
upevníte krycí sklíčko na střed komůrky. Pohledem proti světlu se ujistěte, že komůrka a sklíčko jsou
čisté. V případě potřeby je přetřete buničitou vatou.
5. Kapátko s jemným hrotem umístěte ke hraně krycího sklíčka. Malý tlakem na mikropipetu aplikujte krev
mezi dno Bürkerovy komůrky a sklíčko. Vizuálně ověřte, že kapalina vyplnila celou část mezi sklíčkem a
komůrkou (Obrázek 14-1).
Striktní zásada práce s krví:
Pracujte pouze na vybraných místech. Pracujte pouze v gumových rukavicích a plášti.
Pracujte pouze v gumových rukavicích a plášti!
76
6. Komůrku se vzorkem umístěte na vyhrazené místo na mikroskopu, nastavte okulár na maximální
zvětšení (100x) a začněte ostřit. Dávejte si pozor, abyste sklíčko nepromáčkli. Na obrazovce počítače by
se měly objevit erytrocyty a hrany vyrytých čtverců počítací mřížky (Obrázek 14-2).
7. Erytrocyty počítejte na 40 malých čtverečcích. Výsledek z každého čtverce zaneste do tabulky ve
výsledcích.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
2
1/400 mm2
Obrázek 14-1 Názorná ukázka aplikace vzorku krve na Bürkerovu komůrku.
Obrázek 14-2 Ukázka mřížky Bürkerovy komůrky s udanou plochou malého čtverce.
77
3
4
1.a Údaje potřebné pro výpočet
Celkový počet napočítaných erytrocytů:
…….....................
Průměrný počet erytrocytů v jednom čtverečku:
………………………..
Obsah čtverce:
1/400 mm2
Hloubka komůrky (prostor mezi komůrkou a
sklíčkem): 0,1 mm
Koeficient zředění:
1:200
Udávaná chyba metody:
+/- 200 000 erytrocytů v 1 mm3
1.b Výpočet
𝐏𝐨č𝐞𝐭 𝐞𝐫𝐲𝐭𝐫𝐨𝐜𝐲𝐭ů 𝐧𝐚 𝐥 =
𝐂𝐞𝐥𝐤𝐨𝐯ý 𝐩𝐨č𝐞𝐭 𝐞𝐫𝐲𝐭𝐫𝐨𝐜𝐲𝐭ů
𝐏𝐨č𝐞𝐭 č𝐭𝐯𝐞𝐫𝐞č𝐤ů
𝐎𝐛𝐬𝐚𝐡 č𝐭𝐯𝐞𝐫𝐞č𝐤𝐮 ∙ 𝐇𝐥𝐨𝐮𝐛𝐤𝐚 𝐦𝐞𝐳𝐢 𝐬𝐤𝐥íč𝐤𝐞𝐦 𝐚 𝐤𝐨𝐦ů𝐫𝐤𝐨𝐮 ∗ 𝐤𝐨𝐞𝐟𝐢𝐜𝐢𝐞𝐧𝐭 𝐳ř𝐞𝐝ě𝐧í
∙ 𝐩ř𝐞𝐩𝐨č𝐞𝐭 𝐧𝐚 𝟏 𝐥𝐢𝐭
𝐏𝐨č𝐞𝐭 𝐞𝐫𝐲𝐭𝐫𝐨𝐜𝐲𝐭ů 𝐧𝐚 𝐥 =
… … … … … …
𝟒𝟎
𝟎, 𝟎𝟎𝟐𝟓 ∙ 𝟎, 𝟏 ∙ 𝟎, 𝟎𝟎𝟓
∙ 𝟏𝟎 𝟔
Místo pro výpočet:
78
Výsledný počet erytrocytů:
……………………………………ery/l
8. Počítání provádějte podle pravidla horní/pravý nebo dolní/levý – tj. budete počítat ty erytrocyty, které
se nachází uvnitř čtverce a dotýkají se zvenku horní a pravé hrany čtverce nebo ty, které se zvenku
dotýkají dolní a levé hrany čtverce (Obrázek 14-3).
9. Stanovte průměrný počet erytrocytů v jednom čtverečku a přepočítejte ho na objem 1 litr.
Obrázek 14-3 Ukázka počítání erytrocytů, kdy kromě erytrocytů uvnitř čtverečku uvažujeme také ty, které
se dotýkají zvenku horní a pravé hrany.
79
Hodnocení a výsledky
1.Výpočet počtu erytrocytů přímou metodou
Zaznamenávejte napočítané erytrocyty z každého čtverečku z Bürkerovy komůrky.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
2
3
4
1.a Údaje potřebné pro výpočet
Celkový počet napočítaných erytrocytů:
…….....................
Průměrný počet erytrocytů v jednom čtverečku:
………………………..
Obsah čtverce:
1/400 mm2
Hloubka komůrky (prostor mezi komůrkou a
sklíčkem): 0,1 mm
Koeficient zředění:
1:200
Udávaná chyba metody:
+/- 200 000 erytrocytů v 1 mm3
1.b Výpočet
𝐏𝐨č𝐞𝐭 𝐞𝐫𝐲𝐭𝐫𝐨𝐜𝐲𝐭ů 𝐧𝐚 𝐥 =
𝐂𝐞𝐥𝐤𝐨𝐯ý 𝐩𝐨č𝐞𝐭 𝐞𝐫𝐲𝐭𝐫𝐨𝐜𝐲𝐭ů
𝐏𝐨č𝐞𝐭 č𝐭𝐯𝐞𝐫𝐞č𝐤ů
𝐎𝐛𝐬𝐚𝐡 č𝐭𝐯𝐞𝐫𝐞č𝐤𝐮 ∙ 𝐇𝐥𝐨𝐮𝐛𝐤𝐚 𝐦𝐞𝐳𝐢 𝐬𝐤𝐥íč𝐤𝐞𝐦 𝐚 𝐤𝐨𝐦ů𝐫𝐤𝐨𝐮 ∗ 𝐤𝐨𝐞𝐟𝐢𝐜𝐢𝐞𝐧𝐭 𝐳ř𝐞𝐝ě𝐧í
∙ 𝐩ř𝐞𝐩𝐨č𝐞𝐭 𝐧𝐚 𝟏 𝐥𝐢𝐭
80
𝐏𝐨č𝐞𝐭 𝐞𝐫𝐲𝐭𝐫𝐨𝐜𝐲𝐭ů 𝐧𝐚 𝐥 =
… … … … … …
𝟒𝟎
𝟎, 𝟎𝟎𝟐𝟓 ∙ 𝟎, 𝟏 ∙ 𝟎, 𝟎𝟎𝟓
∙ 𝟏𝟎 𝟔
Místo pro výpočet:
Výsledný počet erytrocytů:
……………………………………ery/l
Impedanční metoda
Srovnejte vaši vypočtenou hodnotu s hodnotou z impedančního měření.
2. Výpočet počtu erytrocytů impedanční metodou
Zaneste výsledky získané z automatického analyzátoru a porovnejte je s vašimi naměřenými výsledky.
Impedanční měření [ery/l] Přímá metoda počítání [ery/l]
……………………………………………..[ery/l] ……………………………………………..[ery/l]
Jaké mohou být důvody rozdílu mezi vašimi výsledky a naměřenými výsledky z automatu?
81
Závěr
Shrňte všechny naměřené výsledky a stručně popište fyziologické jevy, které se s nimi pojí. Pokud jste
naměřili jiné než fyziologické hodnoty, zamyslete se nad možnými příčinami. Jaká je příčina rozdílu počtu
erytrocytů u žen a mužů?
82
URČENÍ KREVNÍ SKUPINY
SKLÍČKOVOU METODOU
Klíčová slova
Antigen, protilátka, aglutinogen, aglutinin, aglutinace, Rh faktor, fetální erytroblastóza.
Pracovní část
Potřeby
Standardní séra skupiny anti A, anti B a anti AB, nesrážlivá krev, emitní miska, miska s dezinfekčním
roztokem.
Postup práce
1. Před začátkem práce zkontrolujte baňky se séry (datum výroby, průhlednost, souhlasné označení a
barvy sér).
Striktní zásada pro práci s krví:
Pracujte pouze ve vyhrazeném prostoru. S krví se manipuluje pouze v gumových rukavicích.
83
2. Na podložní sklíčko aplikujte jednotlivá séra. Každé sérum je rozlišitelné podle svého barevného
označení (modrá – anti A sérum, žlutá – anti B sérum, průhledná – anti AB sérum). Ujistěte se, že na
sklíčku nedochází k mísení sér (Obrázek 15-1 vpravo).
3. Krev v lahvičce opatrně promíchejte a pomocí kapátka aplikujte 1-2 kapky krve na další separátní sklíčko
(Obrázek 15-1). Uzavřete lahvičku s krví a odložte.
4. Připravte si další podložní sklíčko pro přenos krve do sér. Do kapky krve namočte roh podložního sklíčka
a přeneste jej na první sérum. Krouživým pohybem obě kapaliny smíchejte. Poté pootočte sklíčko a
dalším čistým rožkem přeneste krev na další sérum (Obrázek 15-1, Obrázek 15-2). Množství krve a séra
by mělo být v poměru asi 1:10.
Obrázek 15-1 Počáteční příprava krve a sér na oddělená sklíčka. Dejte pozor, aby na sklíčku s jednotlivými
séry nedošlo k jejich vzájemnému promíchání.
Obrázek 15-2 Pro míchání séra a krve použijte vždy jiný rožek tak, aby nedocházelo k promíchání
jednotlivých sér.
Vždy použijte čistý rožek tak, aby nedošlo ke smíchání sér.
84
5. Pozorujte reakci na jednotlivých sérech a výsledky překreslete do připravených obrázků.
Hodnocení a výsledky
Překreslete výsledky pokusu a určete typ testované krevní skupiny. Popište probíhající děje.
Pokus A
Zakreslete výsledky reakce na sérech.
Sérum Anti A Sérum Anti B Sérum Anti AB
Výsledek pokusu:
(Reakce/bez reakce)
Krevní skupina:
………………………………………………
Jakou krevní skupinu mohli mít rodiče majitele této krevní skupiny:
Pokus B
Zakreslete výsledky reakce na sérech.
Sérum Anti A Sérum Anti B Sérum Anti AB
Výsledek pokusu:
(Reakce/bez reakce)
85
Krevní skupina:
………………………………………………
Jakou krevní skupinu mohli mít rodiče majitele této krevní skupiny:
Závěr:
Shrňte všechny naměřené výsledky a stručně popište fyziologické jevy, které se s nimi pojí.
86
STANOVENI KONCENTRACE
HEMOGLOBINU
Klíčová slova
Hemoglobin, hypochromie, hyperchromie, karbaminohemoglobin, karboxyhemoglobin, methemoglobin,
průtoková cytometrie, spektrofotometrie.
Praktická část
Potřeby
Transformační roztok, zkumavka, kapátko, podložní sklíčko, mikropipeta 5000 l, mikropipeta 20 l, emitní
miska, buničitá vata.
Postup práce – spektrofotometrie
1. Zkontrolujte zapnutí přístroje Spekol 11.
2. Do přístroje zasuňte kyvetu se standardem (destilovaná voda) a zmáčkněte C (výstupem přístroje tak
bude hodnota koncentrace v jednotkách mmol/l). Kyvetu vždy uchopujte z její matné (neprůhledné)
strany. Průhledné části kyvety udržujte v maximální čistotě.
3. Stiskem tlačítka FAKT a následně POS a INC nastavte do paměti přístroje faktor pro přepočet absorbance
na látkovou koncentraci hemoglobinu (molární absorpční koeficient methemoglobinkyanidu je 22,8
l·mol-1·cm-1). Hodnota koeficientu je již upravena s ohledem na očekávané naředění krve
transformačním roztokem v poměru 1:250 (20 l krve a 5 ml transformačního roztoku).
4. Stiskem R vynulujte přístroj.
5. Do zkumavky odměřte 5 ml transformačního roztoku (mikropipeta se žlutým značením).
6. Odměřte 20 l krve (mikropipeta s modrým značením).
Obsah kyanidu draselného v transformačním roztoku z něj dělá vysoce toxickou látku při vdechování,
styku s kůží a při požití! Mějte proto předměty které byste mohli potřísnit a posléze se jich dotýkat bez
rukavic mimo pracovní místo (například sešity, tužky, mobil).
Před započetím práce si osoby provádějící cvičení pozorně pročteóu pravidla pro zacházení s touto
látkou.
Upozornění: Student pracující s trasnformačním roztokem pracuje v modrých rukavicích se štítem
před obličejem.
87
7. Obsah mikropipety vyprázdněte do zkumavky s transformačním roztokem, opatrně promíchejte a
čekejte, až dojde k hemolýze erytrocytů (přibližně 5 minut).
8. Kyvetu naplňte pomocí kapátka příslušným roztokem a zasuňte ji do přístroje. Po ustálení hodnot na
displeji odečtěte výslednou hodnotu molární koncentrace hemoglobinu (mmol/l). Hodnotu přepočtěte
na hmotnostní koncentraci [g/l] vynásobením hodnoty molární koncentrace koeficientem 16,11.
Koeficient je odvozen z molekulární hmotnosti hemoglobinu (MHb ≈ 64 440 g/mol). Fyziologicky má
hemoglobin tetramerní strukturu. Po reakci s transformačním roztokem však vzniká stabilní
methemoglobinkyanid, kterého koncentraci reálně naměříme. Struktura této sloučeniny je však
monomerní, proto uvažujeme pouze 1/4 molekulární hmotnosti tetramerního hemoglobinu (MHbk =
16 110 g/mol). Matematická operace pro převod koncentrace z jednotek mmol/l na mol/l je evidentní,
čímž se dostáváme ke zmíněnému koeficientu 16,11.
Postup práce – impedanční cytometrie
Měření na hematologickém analyzátoru Mythic 18 provádí vyučující. Výstupem analýzy je tištěná zpráva (
Obrázek 16-1). Přístroj je kalibrovaný na hodnocení červené krevní řady (viz rámeček).
Obrázek 16-1 Výstupní zpráva z analyzátoru Mythic 18. RBC – erytrocyty (red blood cells), HBG – hemoglobin,
HCT – hematokrit, MCV – střední objem erytrocytů (mean cell volume), MCH – střední množství hemoglobinu
obsažené v jedné červené krvince erytrocytu (mean corpuscular hemoglobin) , MCHC - střední koncentrace Hb
v erytrocytech (mean corpuscular hemoglobin concentration), RDW - anizocytóza erytrocytů (red cell
distribution width).
Rozmezí fyziologických hodnot
JednotkyNaměřené hodnoty
88
Hodnocení a výsledky
Hodnocení výsledků
Proveďte spektrofotometrické i impedanční měření koncentrace. Výsledky měření srovnejte.
Metoda měření
Naměřená hodnota
(číslo)
Naměřená hodnota
(fyzikální jednotka)
Fyzikální
Veličina
Spektrofotometrie
Impedanční cytometrie
Závěr
Porovnejte hodnoty naměřené a spočítané pomocí spektrofotometrické metody a impedanční cytometrie.
Jde o fyziologické hodnoty, pokud ne, na jaké onemocnění mohou poukazovat?