Vyšetřování na rutinní morfologii
Úsek rutinní morfologie
Oddělení klinické hematologie
Fakultní nemocnice Brno
RNDr. Jana Klinerová
Vyšetření krevního obrazu a
diferenciálního rozpočtu leukocytů
• jedno ze základních vyšetření pro diagnostiku a
sledování léčby řady onemocnění
• krevní obraz je komplexní soubor výsledků, které
spolu úzce souvisí
• analýza se provádí na hematologických analyzátorech
• vyšetření se provádí z nesrážlivé periferní krve, jako
protisrážlivé činidlo se do odběrových zkumavek
používá standardně K3EDTA, K2EDTA nebo NA2EDTA
Hematologické analyzátory
• každý má svá jedinečná specifika
• základní principy měření:
– Optická analýza (opticky inaktivní roztok + opticky aktivní buňka)
– Impedanční analýza (vodivý roztok + nevodivá buňka)
– Absorbční spektrofotometrie (stanovení množství hemoglobinu)
• z měření získáváme informace o:
– počtu buněk (kvantitativní analýza)
– velikosti, tvaru a složení buňky (kvalitativní analýza)
• principy měření mohou být na jednotlivých analyzátorech
různě kombinovány
• různé kombinace pak umožňují různě přesnou
kvantitativní i kvalitativní analýzu všech prošlých
buněčných elementů
Impedanční analýza
• je založena na měření změny elektrického odporu (impedance)
při průchodu jednotlivých buněk v průtokové měřící kyvetě mezi
dvěma elektrodami
• mezi elektrodami je standardní vodivost , při průchodu buňky
aperturou se vodivost změní  impedanční impulz (odpor)
• četnost impulzu  počet buněk
velikost impulzu  velikost buňky
• využívá se hydrodynamická fokusace:
unášení jednotlivých buněk proudem kapaliny
• měření může být doplněno například vysokofrekvenční
analýzou: na stejnosměrné elektrické pole → superponováno
vysokofrekvenční elektrické pole → pronikne cytoplazmou →
pak se změří vysokofrekvenční vodivost buňky → ta odpovídá
její fyzikálněchemické struktuře (kvalitativní analýza buňky)
CELL-DYN ® 4000 Customer Training
0
o
Light Loss: SIZE
7
o
Scatter: COMPLEXITY
90
o
Scatter: LOBULARITY
90
o
D Scatter: GRANULARITY
Optická analýza
• využívá se průtoková cytometrie:
(spolu s hydrodynamickou fokusací)
– každá buňka je ozářena monochromatickým laserovým paprskem
– po interakci buňky s paprskem se provádí analýza
– analyzuje se samostatně každá buňka v suspenzi
• detekuje se světlo:
– prošlé (detekce paprsku ve směru 0° poskytuje informace o počtu
a velikosti jednotlivých prošlých buněk)
– odražené a depolarizované (detekce paprsku v různých úhlech
slouží k detekci tvaru a velikosti buňky, jádra a granularity
cytoplazmy)
– fluorescence (barvení buňky speciálními barvami → ozáření buňky
laserovým paprskem → detekce emitovaného světla), detekce
DNA, RNA a CD znaků
Fyziologické hodnoty KO (referenční intervaly)
• WBC (109/l) 4,0 - 10,0
White Blood Cells, leukocyty
• RBC (1012/L)
ženy 3,8 - 5,4
muži 4,0 - 5,9
Red Blood Cells, erytrocyty
• HGB (g/L)
ženy 120 - 160
muži 130 – 176
Hemoglobin
• HCT (1/1)
ženy 0,35 - 0,46
muži 0,39 - 0,51
Hematocrit
• MCV (fl) 84 - 96
Mean Cell Volume
• PLT (109/l) 150 – 400
Platelets, trombocyty
• MCH (pg) 28 - 34
Mean Corpuscular HGB
• MCHC (g/l) 320 - 370
Mean Corpuscular HGB
Concentracion
• RDW (%CV) 10 - 15,2
RBC distribution width
• MPV (fl) 7,8 -11,0
Mean PLT Volume
• PDW 15,5 -17,1
PLT distribution width
• RETI (%) 0,5 - 2,5
Reticulocyte
RETI (109/l) 25 – 75
• NRBC (109/l, NRBC/100WBC),
normoblasty
neutrofilní
segmenty
50 – 70 (%)
neutrofilní tyče
0 – 5 (%)
lymfocyty
20 – 45 (%)
monocyty
2 – 12 (%)
eozinofily
0 – 8 (%)
bazofily
0 – 1 (%)
Diferenciální rozpočet leukocytů
Hodnocení KO
• numerické výsledky
• grafické výsledky (scatergramy, histogramy)
• hlášení analyzátoru
• případná kontrola mikroskopem
• vyšetření poprvé / opakovaně
• typ diagnózy
• pacient: ambulantní, lůžkové odd., JIP…
• vyšetření rutinní, statimové, speciální,
vitální indikace
• výsledky jsou mimo referenční rozmezí
• náhlé změny v KO
• interference
• patologická hlášení
• správný odběr, typ vyšetřovaného materiálu
Fyziologický vzorek
↔
hypogran NE
hypogr
MY
EO
hypogr
MY META
MY
BL MONO
Laboratorní informační systém
Laboratorní informační systém – historie vyšetření
Kontroly KO
• pravidelná kontrola KO i dif
• kontrola správnosti (firemní materiál)
• kontrola přesnosti (vitální krev)
• porovnatelnost (metodik, přístrojů, laboratoří…..)
• správná údržba přístroje (kontroly po údržbě)
• specifická pravidla pro daný analyzátor:
– princip měření
– rozsah hodnot měřených parametrů (linearita)
– hlášení přístroje
– měřený / počítaný parametr, grafy
Zhotovení nátěru krve
• řídí se hodnotou hematokritu (větší úhel = silnější nátěr)
• potřeby: podložní sklíčko, roztírací sklíčko
• roztírací sklíčko položit před kapku krve na podložním skle
pod úhlem cca 30 ° - 40° (nikdy ne do kapky krve); po doteku
krve a roztíracího skla se krev rozlije podél hrany skla; poté
rychle krev rozetřít po podložním skle
• sílu nátěru zvažovat – čím větší úhel, tím silnější nátěr
• nátěr musí být: rovnoměrný, přiměřeně tenký, dlouhé okraje
musí být rovné, na konci přechází „do ztracena“ (alespoň 1 –
2 cm)
Barvení
• správné provedení nátěru, zaschnutí, fixování (metanol +
barviva), barvení nátěrů (metanol +glycerin +fosfátové pufry
+barviva), pH 6,8 - 7,0
• Nejběžnější metoda barvení je Pappenheimova:
May-Grűnwald / Giemsa-Romanowski
nejpoužívanější metoda, ve všech směrech zcela uspokojující
• preparáty lze také připravovat na nátěrových a barvících
automatech
- Kationtové (zásadité) barvy, jako je např.
azur B, se váží na aniontovou složku a
dávají modrošedá zbarvení nukleových
kyselin (DNA nebo RNA), nukleoproteinů,
granulí bazofilů a slabě barví granula
neutrofilů.
- Aniontové (kyselé) barvy, jako je např.
eosin Y, se váží na kationtovou složku
proteinů a dávají oranžovočervená
zbarvení hemoglobinu a eozinofilním
granulím
Hodnocení PLT
• velikost (MPV, PDW, distribuční křivka)
• kontrola mikroskopicky při početních a morfologických anomáliích
• hodnocení granulace, shluků (satelitózy), přítomnost MGK, holá
jádra MGK
• speciální odběr (falešné trombocytopenie – vliv EDTA, satelitóza
PLT) - odběr do hořčíku Mg2+ Tromboexact (nebo citrátu)
• opticky (vyloučí netrombocytární elementy)
• Imunologické vyšetření (CD61)
• Interference PLT: mikro RBC, makro PLT (sraženiny),
buněčné/nebuněčné fragmenty
makro PLT
satelitóza PLT
Hodnocení RBC
• měřené parametry: RBC, HGB, MCV (HCT)
• počítané parametry: HCT (MCV), MCH, MCHC, RDW + distribuční křivka (šířka,
vrcholy)
• z měřených parametrů nelze jasně sledovat morfologii
• v vypočítaných parametrů a distribučních křivek lze sledovat
- MCV: normocyty, mikrocyty, makrocyty (izocytóza,
anizocytóza)
- MCH, MCHC: normochromie, hypochromie, hyperchromie
- RDW+křivka: homogenita, heterogenita populace
• interference RBC: sraženiny/mikrosraženiny PLT, aglutinace
• mikroskopické hodnocení RBC: tvarové odchylky, buněčné inkluze, shluky,
rozložení, jaderné elementy (NRBC)
Poikilocyty –
tvarové odchylky erytrocytů
• akantocyty
• echinocyty
• terčovité
• knizocyty
• stomatocyty
• sférocyty
• eliptocyty
• slzičkovité
• schistocyty - fragmenty erytrocytů
• keratocyty
• srpkovité
Inkluze v erytrocytech
• Bazofilní tečkování (degradované zbytky RNA v
organelách)
• Howell-Jollyho tělíska (jaderné fragmenty
obsahují DNA)
• Cabotovy prstence (mikrotubuly z mitotického
vřeténka nebo zbytky jaderné membrány)
• Pappenheimerova tělíska (granula obsahují
zásobní železo, agregují
s mitochondriemi a ribozomy)
Penízkovatění (rouleax)
- erytrocyty tvoří „řetízky“
(tři a více buněk)
Příčina
zvýšené množství
plazmatických proteinů
navázaných na povrchu
erytrocytů
X Aglutinace
seskupené erytrocyty do
větších, či menších shluků
Příčina
přítomnost protilátek
(nejčastěji chladové)
Hodnocení leukocytů
• Velikost buněk: malé, střední, velké
• Charakteristika jádra: jaderné stíny, holá jádra, poměr
jádra k cytoplazmě, jaderný chromatin, jadérka
(přítomnost, nepřítomnost, počet, velikost), členitost a tvar
jádra (variantní lymfocyty, reaktivní lymfocyty), velikost
jádra (tyče, metamyelocyty), hypo-,hyper segmentace NE
• Charakteristika cytoplazmy: granulace, bez granulace,
specifická, nespecifická, toxická granulace, barevný odstín
cytoplazmy (zralost buňky, reaktivní lymfocyty),
vakuolizace, barevné inkluze, Auerovy tyče, okraje
cytoplazmy (členité, hladké, vlasaté)
Velké granulované lymfocyty – LGL (large granular
lymphocytes)
substrát
↓
inkubační roztok
+
enzym
↓
buňka

obarvené precipitáty
↓
v místech přítomnosti enzymu
v buňce (v granulích)
Cytochemická reakce
hodnocení:
intenzita zbarvení granulí
je úměrná množství enzymu
Cytochemie
• Myeloperoxidáza – myeloidní buňky, Auerovy tyče
• Nespecifická esteráza – zeslabení pozitivity po přidání
NaF u monocytárních buněk
• PAS – průkaz sacharidů, vzhled pozitivity
Cytochemická vyšetření hodnotit v souvislosti s:
• ostatním cytochemickým vyšetřením
• morfologickým hodnocením a rozpočtem kostní dřeně
• stádiem vyzrávání buněk
zbarvení, obsah
cytoplazmy
velikost, tvar
jádra
struktura chromatinu,
jadérka
komplexní hodnocení
Sledování buněčných morfologických změn
Neutrofilní tyč (rozdíl mezi nejširším a nejužším tvarem jádra je 1/3 až ½)
Neutrofilní segment
Eozinofily
Bazofily
Monocyty
Lymfocyty
Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705)