Možnosti vyšetření funkčnosti buněk imunitního systému Marcela Vlková FN u sv. Anny v Brně LF MU v Brně Ústav klinické imunologie a alergologie [USEMAP] HODNOCENÍ SPECIFICKÉ BUNĚČNÉ IMUNITY •Základní klinické projevy poruch specifické buněčné imunity: •Opakované těžce probíhající infekce špatně odpovídající na léčbu: •Plíce, GIT, kůže •Virové infekce •Intracelulární bakterie (M. tuberculosis) •Oportunistické infekce (různé Candida, Pneumocysitis carinii) • •hodnocení specifické reakce lymfocytů je nutné pro efektivní diagnostiku: •primárních imunodeficiencí •sekundárních imunodeficiencí – infekce, autoimunitní onemocnění, malnutrice, trauma, nádory, účinky terapie [USEMAP] Druhy lymfocytů a jejich funkce •T-lymfocyty •Proliferace - množení •Pomocné CD4+ - Th lymfocyty produkce cytokinů k aktivaci makrofágů, pomoc cytotoxickým a B-lymfocytům •Cytotoxické T-lymfocyty: zabíjení infikovaných buněk, produkce cytokinů •B-lymfocyty: •produkce protilátek •produkce cytokinů •proliferace •NK – buňky: •aktivace •zabíjení infikovaných či nádorových buněk [USEMAP] Funkční testy lymfocytů •Stimulace plné krve nebo mononukleárních buněk (PBMC) nebo izolovaných populací •Sledování: •Proliferace •Produkce cytokinů •Produkce protilátek •Exprese aktivačních a kostimulačních molekul •Sledování aktivace transkripčních faktorů • •K výše uvedeným metodám používáme: •In vitro kultivace •Kultivační média, růstové faktory, aktivační látky, cytokiny •Atmosféra CO2 •Teplota 37°C • [USEMAP] Možnosti separace - historické shrnutí •První pokusy o separaci jednotlivých typů leukocytů kolem r. 1960 •Používání fyzikálních charakteristik (hustota) nebo biochemických odlišností (přítomnost specifických enzymů) (např. L-leucin-metylester je toxický pro monocyty s obsahem lysozymů a NK buňky) •1968 Boyum publikoval metodu separace na hustotním gradientu (FICOLL) • Podobné metody používaly arabinogalaktan (stractan) 13-17% • 80. léta – objevují se metody separace založené na reakci Ag-Ab •Rozetové metody •Adherence makrofágů k plastům, B buňky + nylonová vlna [USEMAP] Principy separace • Podle čeho se separuje •Fyzikální vlastnosti • Velikost buněk • Hustota (densita) •Rychlost sedimentace při centrifugaci •Biologické vlastnosti: •Přirozené schopnosti buněk (adherence buněk na plastik) •Povrchová exprese receptorů – možnost navázání protilátek •Kritéria pro výběr metody •Čistota a výtěžek separace •Doba zpracování •Finanční náročnost [USEMAP] Separace buněk •Výchozí materiál: • Solidní orgán: Tkáň se rozřeže na malé částečky, které se ponoří do kultivačního média. Buňky pak rostou v kultivační nádobě. •Tkáň se rozvolní na jednotlivé buňky • mechanicky homogenizátorem, • enzymatickým natrávením -trypsinem, kolagenázou, pronázou, dispázou, elastázou,… • Krev, kostní dřeň – již rovnou buněčná suspenze •Směsné populace buněk – pro funkční testy potřeba izolovat určitý typ buněk od ostatních populací buněk •Nádorová tkáň: oddělení nádorových buněk od nenádorových •Kostní dřeň: CD34+ kmenové buňky od ostatních buněk •Krev: izolace různých typů leukocytů [USEMAP] Typy leukocytů [USEMAP] Základní separace krevních složek •Používá se na transfuzních stanicích •Nesrážlivá krev se centrifuguje rychlostí 1500-2000g (300-3400rpm) •Krev se rozdělí na tyto složky: •Červené krvinky •Plazma bohaté na destičky •Buffy coat – bílé krvinky a destičky •Destičky jsou separovány z vrchní frakce a z buffy coatu • [USEMAP] Odstraňování erytrocytů – hypotonická lýza •Založeno na větší náchylnosti erytrocytů k hypotonickému šoku ve srovnání s ostatními leukocyty na základě méně stabilní membrány erytrocytů •Používané metody: •Osmotická lýza chloridem amonným ( 0,84%) •Destilovanou vodou •Změnou pH – kyselina mravenčí •Poté následuje návrat buněk do izotonického prostředí •Použití – příprava vzorků pro průtokovou cytometrii: •Značení protilátkami •Lýza erytrocytů •Promytí •Měření na cytometru a analýza [USEMAP] Získání PBMC pomocí nespojité gradientové centrifugace •Princip spočívá v navrstvení na sebe dvou roztoků o různých hustotách •Při navrstvování tvoří horní vrstvu plná krev •Po centrifugaci zůstanou mononukleární buňky mezi roztoky s vyšší a nižší hustotou •Jako hustotní médium se používají sacharidová média nebo složité sacharidy (Ficoll) •Ficoll 400 – syntetický vysokomolekulární polymer sukrózy a epichlorohydrinu. MR. 400 000 •Ficoll Pague – separační činidlo – vodný roztok o hustotě 1,077g/ml - obsahuje 5,7g Ficollu 400 a 9g ditrazoátu sodného [USEMAP] Gradientová centrifugace – separace mononukleárních buněk z plné nesrážlivé krve Plná krev se opatrně navrství na hustotní médium Následuje centrifugace – 20-30 min Separace jednotlivých složek krve – viz obrázek [USEMAP] Separace monocytů pomocí adherence na plastové povrchy •Užíváno obvykle po separaci PBMC •Monocyty – přirozená schopnost adherovat na povrch kultivačního plastiku – probíhá několik hodin •Ostatní buňky, zejména lymfocyty zůstávají plovoucí v médiu •Čistota separace: kolem 70-80% •Účinnost separace: méně než 50% •Výhody: finančně nenáročné •Nevýhody: •účinnost a prodloužená doba separace •variabilita mezi dárci • [USEMAP] Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků – reakce antigen (Ag) a protilátka (Ab) •Tvorba rozet •Imunomagnetická separace •Sortování buněk pomocí průtokové cytometrie [USEMAP] Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků – tvorba rozet •Lymfocyty tvoří shluky s červenými krvinkami – tzv. rozety, viditelné pod mikroskopem, jako lymfocyt obklopený erytrocyty •Používají se k izolaci T-lymfocytů, B-lymfocytů – založeno na přítomnosti specifických receptorů CD2 a LFA •T-lymfocyty: exprese molekuly CD2, na kterou se váží beraní erytrocyty – tzv. E- rozety •B-lymfocyty: exprese molekuly LFA (Lymphocyte function-associated antigen) vážící myší erytrocyty – M-rozety •Nenavázané erytrocyty se odstraní hypotonickou lýzou nebo je možné rozety separovat pomocí gradientové centrifugace – využívají zejména komerční kity: •rozety vytvořené pomocí protilátek [USEMAP] Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků •Pozitivní separace: z buněčné suspenze je pomocí specifického markeru za přítomnosti specifických protilátek navázána a poté izolována konkrétní buněčná populace: •CD3 – T-lymfocyty •CD19, CD20 - B-lymfocyty •CD15 – neutrofily…… •Negativní separace nebo deplece: z buněčné suspenze jsou odstraněny pomocí specifických protilátek buňky, které nejsou cílem separace •Oba přístupy mohou být kombinovány – při hledání složitěji definovaných subpopulací – přiklad izolace T regulačních lymfocytů •Čistota separace se obvykle pohybuje na 90% • [USEMAP] Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků – reakce Ag a protilátka •Na nosič navázaná protilátka proti Ag specifickému pro hledanou buněčnou populaci •Různé vlastnosti nosiče – magnetismus, hustota, velikost – umožnění separace protilátkou označených buněk •Možnost využití principu sloupcové chromatografie – protilátky jsou konjugovány s kuličkami: kuličky s navázanými buňkami jsou při separaci zadrženy v koloně nebo ve zkumavce a teprve po odmytí nenavázaných buněk následuje proces vyplavení buněk navázaných na kuličky •Výhody: vysoká čistota a výtěžek •Nevýhody: časová a finanční náročnost [USEMAP] Separace populací leukocytů na základě povrchových znaků, reakce Ag a protilátka: Magnetická separační kolona •Suspenze buněk se inkubuje s magnetickými partikulemi označenými monoklonální protilátkou proti specifickému receptoru přítomnému na hledané populaci buněk •Poté prochází buněčná suspenze kolonou umístěnou v silném magnetickém poli •Magneticky „označené“ buňky jsou zadrženy v koloně – ostatní neznačené buňky odtečou z kolony pryč •Po vyjmutí kolony z magnetického pole jsou zadržené buňky vymyty •Obě populace jsou použitelné k dalším experimentům • [USEMAP] Imunomagnetická separace – pozitivní selekce [USEMAP] Imunomagnetická separace – negativní selekce [USEMAP] MACS – automated Magnetic Cell Sorting •Komerční soupravy k izolaci libovolné buněčné subpopulace na magnetické koloně •Použití magnetických partikulí konjugovaných s monoklonálními protilátkami •Buňky lze separovat přímo z plné krve za 40minut, čistota 95-98% •Rychlost metody – až 10milionu buněk za sekundu •Kompatibilní s průtokovou cytometrií – lze zároveň provádět fluorescenční i magnetické značení [USEMAP] FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting •Založeno na principu průtokové cytometrie • - buňky v suspenzi jsou označeny monoklonální protilátkou s navázaným fluorochromem •Při průchodu detektorem je pomocí elektrického výboje cílová buňka vychýlena ze své dráhy a nasměrovaná do sběrné zkumavky •Vysoká čistota separace •Průchod až 50 000 buněk za vteřinu • [USEMAP] FACS – Fluorescence Activated Cell Sorting •Výhody •Možnost přesné definice cílové buněčné populace pomocí vhodné kombinace protilátek •Vysoká čistota • •Nevýhody: •Finančně náročné na přístrojové vybavení i provedení pokusu •Časová náročnost •Ovlivnění životnosti buněk •Obtížné zajištění sterility •Nízké výtěžky • • [USEMAP] Funkční testy lymfocytů •Stimulace plné krve nebo mononukleárních buněk (PBMC) nebo izolovaných populací •Sledování: •Proliferace •Produkce cytokinů •Produkce protilátek •Exprese aktivačních a kostimulačních molekul •Sledování aktivace transkripčních faktorů • •K výše uvedeným metodám používáme: •In vitro kultivace •Kultivační média, růstové faktory, aktivační látky, cytokiny •Atmosféra CO2 •Teplota 37°C • [USEMAP] Aktivace T-lymfocytů •T-lymfocyty poznávají antigeny pouze ve formě peptidových fragmentů vázaných na MHC I nebo II. (Fenomen MHC-restrikce) na antigen prezentujících buňkách (APC) – dendritické buňky, makrofágy •Antigen musí být nejdříve v APC „zpracován“ (processing)- nativní protein je proteolyticky degradován na peptidy, které se intracelulárně váží na molekuly MHC. Tento komplex se dostává na buněčnou membránu antigen prezentující buňky, kde je schopen reagovat s T-lymfocytem prostřednictvím TCR, který je pro daný Ag specifický. •Každý T-lymfocyt v krvi může být specifický pro jiný Ag – je nutné najít látky schopné aktivovat všechny T-lymfocyty [USEMAP] schema_2_1-01.png Aktivace TCR antigenem a superantigenem MHC class II Aktivační signál Superantigen T cell APC TRC Aktivační signál α β α β α β α β Antigen Příklady superantigenů: phytohemagglutinin (PHA) concanavalin A (ConA) pokeweed mitogen (PWM) [USEMAP] Funkční vyšetření T-lymfocytů •Aktivace •Proliferace •Produkce cytokinů •Vyšetření exprese kostimulačních molekul CD40L, ICOS, CTLA4 • •Průběh aktivace lymfocytů je možné sledovat pomocí povrchových markerů exprimovaných v určitých fázích aktivace na povrchu nebo uvnitř lymfocytů [USEMAP] Změny povrchových molekul na povrchu T-lymfocytů během aktivace © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com [USEMAP] Příprava vzorku •Nesrážlivá krev odebraná do Heparinu – v případě přímé stimulace v plné krvi •Odběr do EDTA – nutnost odmytí kyseliny diamin tetraoctové – chelatuje kalcium a tím fixuje lymfocyty - izolace PBMC •Naředěná krev či izolované buňky se napipetují do jamek kultivační destičky, přidá se médium, stimulátory a aktivuje se: •Aktivace: 4-24 hod v závislosti na použitém stimulans •Proliferace: nejméně 2-3 dny, v závislosti na druhu stimulace •Produkce cytokinů: 4-72 hod – v závislosti na druhu cytokinů [USEMAP] Aktivace a proliferace T-lymfocytů •Časná aktivace – vyšetření povrchových znaků CD69 – vystupuje na povrch 4hodiny od začátku aktivace v závislosti na způsobu aktivace •CD25- vystupuje na povrch po 12-ti hodinách od začátku aktivace •Proliferace – schopnost T-lymfocytů množit se po Ag stimulaci •phytohemagglutinin (PHA) (Fazole zahradní) •concanavalin A (ConA) (Jack Bean) •pokeweed mitogen (PWM) (Líčidlo americké) •Anti-CD3+ anti- CD28 • [USEMAP] Měření aktivace a proliferace T-lymfocytů •Aktivace - metodou průtokové cytometrie •Proliferace: •Inkorporace radioaktivně značeného thymidinu •Inkorporace bromdeoxiuridinu či jiných analogů do DNA, jejich následné označení a měření : spektrofotometricky, fluorescenčně, průtokovou cytometrií •Měření Ag Ki-67 – jaderný protein, podílející se na regulaci buněčného dělení, exprimuje se pouze při proliferaci buňky – detekce: průtoková cytometrie •Poznámka – jedná se o měření jaderného Ag, nutnost fixace a permeabilizace membrány [USEMAP] [USEMAP] Měření aktivace T-lymfocytů pomocí průtokové cytometrie Exprese CD25 bez stimulace Exprese CD25 po stimulaci [USEMAP] Měření proliferace T-lymfocytů pomocí průtokové cytometrie Nestimulované Stimulované PHA Exprese Ki-67 bez stimulace Exprese Ki-67 po stimulaci [USEMAP] Měření produkce cytokinů •V plazmě – odráží spíše činnost monocytů •V supernatantu kultivovaných buněk •Použité metody •ELISA •Přímo v buňkách – průtoková cytometrie nutné přidat Brefeldin nebo Monensim, látky zabraňující vyplavování cytokinů ven z buňky • ELISPOT [USEMAP] Th1, Th2 a Th17 lymfocyty © Elsevier 2012. Abbas & Lichtman: Cellular and Molecular Immunology 7e www.studentconsult.com [USEMAP] Produkce cytokinů – IFN gamma po 18 hod stimulace – vyšetření pomocí průtokové cytometrie [USEMAP] Měření aktivace transkripčních faktorů, příklad aktivita NF-κB •Po přijetí aktivačního signálu dochází v lymfocytu nebo dalších buňkách imunitního systému k postupnému zapojování jednotlivých transkripčních faktorů. Jedním z nejdůležitějších je transkripční faktor NF-κB • tvořen skupinou transkripčních faktorů, k nimž patří pět známých členů: p50, p52, RelA (p65), c-Rel a RelB •Aktivace je regulována udržováním NF-κB v inaktivní formě v cytoplazmě nestimulovaných buněk vazbou na inhibiční molekulu zvanou IκB. • Působením některých podnětů dochází k degradaci IκB a následnému uvolnění NF-κB. •Volný NF-κB vstupuje do jádra, kde interaguje s cílovými geny – vede k aktivaci buňky •Změna v aktivaci nebo regulaci aktivace NF-κB u primárních imunodeficienci, nádorových buněk apod. [USEMAP] Měření zvýšené fosforylace NF-kB: B-lymfocyty Non-stimulated Stimulation 10min LPS Zdravá kontrola Pacient Non-stimulated Stimulation 10min LPS [USEMAP] ELISPOT •Buď monoklonální nebo polyklonální protilátka specifická pro zvolený analyt je předem navázána na PVDF (polyvinyliden-difluorid), který je na povrchu jamek mikrodestičky. •Stimulované buňky se pipetují do jamek a mikrodestička se umístí do zvlhčeného CO2 inkubátoru a inkubují se při 37 ⁰C po určitou dobu. •Aktivace buňky - uvolnění cytokinu, protilátky, chemokinu, apod. •Vylučovaná látka = analyt se váže na imobilizovanou protilátkou na dně jamky destičky – je v bezprostřední blízkosti sekrečních buněk [USEMAP] ELISPOT •Cytokin je tedy "zachycen" navázanými protilátkami v oblasti přímo obklopující sekreční buňku předtím, než má šanci difundovat do kultivačního média, nebo být degradován proteázami a vázán na receptory na okolních buňkách •Po odstranění všech buněk a nenavázaných látek se do jamek přidá biotinylovaná polyklonální protilátka specifická pro zvolený analyt. •Následuje promytí nenavázaných biotinylovaných protilátek, přidání alkalické fosfatázy konjugované se streptavidinem. •Nenavázaný enzym se následně odstraní promytím a přidá se roztok substrátu (BCIP / NBT - Nitrotetrazolium blue chloride ). •Vzniká modročerná sraženina a objevuje se jako skvrny na místech lokalizace cytokinů, přičemž každé jednotlivé místo představuje buňku, která vylučuje studované analyty. •Místa mohou být počítána pomocí automatizovaného čtecího systému ELISpot nebo ručně pomocí stereomikroskopu. [USEMAP] ELISPOT Související obrázek [USEMAP] Výsledek ELISPOT [USEMAP] Shrnutí •Funkční testy jsou v současné době nejen výzkumným prostředkem, ale i rutinním vyšetřením: •Sledování proliferace u imunokompromitovaných pacientů a u nádorových onemocnění •Sledování produkce cytokinů u septických pacientů (IL-6) •Sledování exprese kostimulačních molekul • stanovení diagnózy hyper IgM syndrom při poruše exprese CD40ligandu [USEMAP]