Imunoanalytické metody RNDr. Alena Mikušková FN Brno – Pracoviště dětské medicíny, OKB Imunochemické metody •Založeny na reakci antigenu Ag s protilátkou Ab –tj. na reakci antigenních determinant s vazebným místem protilátky – •Antigen •Kompletní antigen = makromolekulární nosič (protein, polypeptid, polysacharid, nukleoprotein,…) + antigenní determinant (= epitop = určitá skupina atomů na povrchu molekuly antigenu) –navozuje specifickou imunitní odpověď –reaguje s produkty této odpovědi (protilátkami) • •Hapten = nekompletní antigen = nízkomolekulární látka, specificky reaguje s protilátkami, sama tvorbu protilátek nenavozuje • •Protilátky •Glykoproteiny, elfo pohyblivost β – γ (imunoglobuliny – Ig) –produkty plazmatických buněk (ty se vyvíjejí z B-lymfocytů po stimulaci antigenem) Protilátky •Monoklonální – produkty jednoho klonu plazmatických buněk –připraveny hybridomovou technologií (fúze myelomových buněk s vyselektovaným klonem lymfocytů sleziny imunizovaných myší - výrazně specifické - vážou se jen na jeden epitop •Polyklonální – příprava imunizací zvířete –namířeny proti různým epitopům antigenu •Lehké řetězce – κ, λ •Těžké řetězce – γ, μ, α, ε, δ –určují třídu imunoglobulinu IgG, IgM, IgA, IgE, IgD •2 vazebná místa pro antigen (kromě IgM = pentamer → 10) • antibody Imunochemické metody •Aglutinační metody – kvalitativní, semikvantitativní •shlukování mikroskopických částic s obsahem povrchových antigenů, např. krvinek, baktérií apod. pomocí protilátek •určování bakteriálních kmenů, průkaz protilátek proti patogenům •hematologie – určování krevních skupin a průkaz Ab proti krevním elementům aglutinace5 Aglutinační metody aglutinace4 •Vyšetření antigenů Rh fenotypu a antigenu Kell na mikrodesce aglu aglutinace3 • ABO Precipitační metody •„Klasické“ metody - vznik nerozpustného precipitátu – imunodifúze, imunoelektroforéza •Jednoduchá + dvojitá radiální imunodifúze • • • • • • • • •Imunoelektroforéza „Raketky“ Dvourozměrná imunoelfo • • • • • • • • Již nepoužívané !!! jednoduchá imunodifúze dvojitá id Dvourozměrná imunoelfo imunoelfo raketky Současné imunoelektroforetické techniky: • Imunofixace • •rozdělení vzorku na gelu –elektroforéza, izoelektrická fokuzace •následná aplikace antiséra ═Ab proti konkrétním těžkým nebo lehkým řetězcům •Anti-IgG značené peroxidázou •vznik imunokomplexů •promytí gelu + barevná vizualizace oligoklonálních pásů •chromogen = substrát peroxidázy • •Stanovení a typizace monoklonálních imunoglobulinů a jejich frakcí v séru / moči imunofixace Současné imunoelektroforetické techniky • Imunoblotting • •elektroforetická separace proteinů na polyakrylamidovém gelu •elektroforetický přenos proteinu na nitrocelulozovou membránu –tzn. vytvoření přesné „repliky“ •antigeny na membráně lépe přístupné protilátkám •aplikace enzymem značené protilátky – vznik komplexu •vizualizace skvrn –po přidání substrátu enzymu vzniká zbarvení WB x Anti Yo blotting Imunoturbidimetrie •Imunoprecipitace založená na interakci antigen - protilátka –vytvoření suspenze imunoprecipitátu v kyvetě → zákal. •podmínka: přítomnost polyvalentního antigenu (reakce antigenu s více epitopy) •Imunoprecipitát = prostorová mřížka, kde se propojují epitopy (vazebná místa) antigenu s paratopy (vazebná místa) protilátek •imunoprecipitační křivka = vyjádření množství imunoprecipitátu na množství protilátky a antigenu •V oblasti nadbytku protilátky je množství komplexu Ag-Ab úměrné koncentraci Ag •v reakci nadbytek Ab –vzestupná část křivky •změření intenzity světla pohlceného zákalem –spektrofotometr •stanovení koncentrace antigenu ve vzorku imunoprecipitační křivka Imunonefelometrie •měření intenzity světla rozptýleného zákalem –vychází z roztoku všemi směry –měření se pod úhlem odlišným od směru dopadajícího záření •obvykle 45° nebo 90° •nefelometr - zdrojem záření je obvykle laser •stanovení koncentrace antigenu stejně jako u imunoturbidimetrie » » Nefelometrie = citlivější ! • Imunoturbidimetrie, imunonefelometrie –stanovení plazmatických proteinů –CRP –imunoglobuliny –specifické proteiny –koagulační faktory,… Imunoturbidimetrie_a_imunonefelometrie Moderní kvantitativní imunochemické metody •neprecipitační imunoanalýzy se značenými reaktanty (tzv. konjugáty) •rychlé, citlivé, často automatizované, detekční limit řádově mg/l – pg/l • •Značení v imunoanalýze: •radioizotop – radioimunoanalýza = Radio Immuno Assay - RIA •enzym – enzymoimunoanalýza – Enzyme Immuno Assay - EIA •fluorescenční látka – fluoroimunoanalýza – Fluoro Immuno Assay - FIA •chemiluminiscenční látka – luminoimunoanalýza – Luminiscence IA - LIA •atd. • •Uspořádání imunochemické reakce: •kompetitivní •nekompetitivní Imunochemická reakce v kompetitivním uspořádání •provedení – v nadbytku antigenu •smíchání séra s neznámým obsahem antigenu Ag se známým množstvím značeného antigenu Ag* (konjugát) •soutěžení Ag a Ag* o vazebná místa omezeného množství protilátek –navázání v tom poměru, v jakém byly v původní směsi •případné odstranění nenavázaných látek + detekční reakce • • • • • • • • • • • • • • • - analyt – Ag ze vzorku • - konjugát – Ag* • - odezva nepřímo úměrná konc. Ag ve vzorku • •vhodné pro stanovování malých molekul s jednou determinantou –hormony (steroidní, tyroidní), léky nepřímá úměra IA TDx IA TDx2 Imunochemická reakce v nekompetitivním uspořádání •Stanovení antigenu: •První protilátka Ab v nadbytku (navázaná na pevnou fázi) •Přidání vzorku obsahujícího antigen Ag - 1. imunochemická reakce –odstranění nenavázaných složek séra promytím •Přidání druhé (značené)* protilátky Ab* – 2. imunochemická reakce (s další antigenní determinantou) →vznik sendvičového komplexu Ab-Ag-Ab* •Odstranění nenavázaných složek séra promytím •Detekční reakce - odezva přímo úměrná koncentraci Ag ve vzorku •Vhodné pro stanovení velkých antigenů s několika vazebnými místy pro Ab sendvič Imunochemická reakce v nekompetitivním uspořádání •Stanovení protilátky • •Na pevné fázi navázán antigen v nadbytku •Přidání vzorku – reakce Ab ze vzorku s imobilizovaným Ag –promytí – odstranění nenavázaných složek •Přidání 2. protilátky Ab* (značený anti-Ig) •Promytí a detekční reakce –odezva přímo úměrná koncentraci Ab ve vzorku – – – –…a další komplikovaná uspořádání nekompetice Uspořádání imunochemické reakce •Dle nutnosti separace volného a vázaného konjugátu (značené Ag* nebo Ab*): • • odkud pochází signál – z volného nebo navázaného Ag* ?? •Heterogenní metody –Po vzniku imunokomplexu se vlastnosti signálu Ag* resp. Ab* nemění –Nutnost separace – např. komplex navázaný na pevnou fázi •jamka mikrotitrační destičky, paramagnetické částice,… • •Homogenní metody –Využívají změny signálu Ag* resp. Ab* po vzniku imunokomplexu •bez nutnosti separace signál Radioimunoanalytické (izotopové) metody •Ag* nebo Ab* značené radionuklidem –γ-zářiče 125I, 57Co, … •měření aktivity γ-záření (scintilační detektor) •Heterogenní metody (nutnost separace komplexu) –imobilizace Ab na pevnou fázi (př. jamka mikrodestičky) – •RIA – Radio Immuno Assay –Kompetitivní Ab-Ag, Ab-Ag* – – •IRMA – Immuno Radiometric Assay –Sendvičová Ab-Ag-Ab* – – – •Použití: hormony, léčiva, (auto)protilátky,… • •Citlivé x nestálé reagencie, nebezpečí práce s radioaktivním materiálem komp nekomp Enzymoimunoanalýza - EIA •Značení Ag nebo Ab = enzym –ALP, β-galaktosidáza, glukózaoxidáza, křenová peroxidáza,… •Indikační reakce – vznik barevného produktu po přidání substrátu enzymu • ØEMIT – Enzyme Multiplied Immunoassay Technique –Homogenní kompetitivní enzymová imunoanalýza •Ag a Ag* soutěží o vazebná místa na Ab •Při vzniku imunokomplexu je enzymová aktivita inhibována –Měří se barevný produkt enzymové reakce nezreagovaného konjugátu •Odpadá nutnost separace volného a vázaného konjugátu •Použití – stanovení nízkomolekulárních antigenů a haptenů –peptidové hormony –léčiva,… EMIT Enzymoimunoanalýza - EIA ØELISA – Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay •Heterogenní enzymová imunoanalýza –Ab nebo Ag navázány v jamce mikrotitrační destičky –nenavázané složky jsou po každém kroku vymyté •Technika existuje v řadě modifikací •Stanovení širokého spektra analytů –„zlatý standard“ měření – jednotlivých proteinů ØMEIA – Microparticle EIA •heterogenní enzymová IA –na mikročásticích •Imunokomplex značený enzymem (ALP) –ALP rozkládá fluorogenní substrát ELISA ELISA3 Fluoroimunoanalýza - FIA •Ag* nebo Ab* značeny fluoroforem (př. fluorescein) –Po dokončení imuno reakce je fluorofor excitován UV zářením, měří se fluorescence • ØFPIA – Fluorescence Polarization Immunoassay – homogenní kompetitivní IA •Rozlišení volného a vázaného Ag* je založeno na rozdílné rotaci molekul v roztoku –fluorofor excitován polarizovaným UV světlem –malá molekula volného Ag* rotuje rychle – sekundární záření je depolarizované –- Stanovení malých Ag (haptenů) – léky, drogy FPIA princip DELFIA - Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent ImmunoAssay •Ab* nebo Ag* označeny fluoroforem – chelátem lanthanidu –europium, sammarium, terbium, dysprosium (přednostně Eu) •Po proběhlé imunochemické reakci je Eu vytrženo z komplexu a přeměněno na nový intenzivně fluoreskující chelát –dlouhotrvající fluorescence s velkým Stokesovým posunem –časově modulované měření fluorescence chelátu lanthanidů •omezení interference matrice •Citlivá metoda, heterogenní, kompetitivní i nekompetitivní DELFIA schema Fluo2 a2 lampy zkumavky FIA LIA Luminoimunoanalýza - LIA •Luminiscenční značka – chemiluminofor –emitované záření je výsledkem chemické reakce •Heterogenní analýzy –Pro separaci využívají magnetické částice • •LIA - kompetitivní •ILMA – nekompetitivní (sendvič) • •CMIA (Chemiluminescent Microparticle IA) •Záchytové molekuly (Ab resp Ag) fixovány na povrchu paramagnetických částic •Značení Ag* resp. Ab* acridiniem –oxidace acridinia pomocí H2O2 v alkalickém prostředí – –Velmi citlivé metody paramag acridinium Luminoimunoanalýza - LIA •Elektrochemiluminiscence – technologie Elecsys (Roche) –Záchytová molekula (protilátka nebo antigen) biotinylována –značení Ag* nebo Ab* = rutenium(II) tris-bipyridylový komplex –kompetitivní nebo sendvičová imunoreakce –přidání mikročástic potažených streptavidinem •celý imunokomplex se váže na pevnou fázi interakcí biotinu se streptavidinem –zachycení mikročástic magnetickým polem na povrchu elektrody –přidání substrátu tripropylaminu (TPA) a přivedení napětí na elektrody •ruthéniový komplex uvolní na elektrodě elektron za vzniku Ru(bpy)3 3+ kationtu - elektrochemiluminiscenční emise Elecsys elecsys2 Proužkové testy – rychlá imunochemická diagnostika •Imunoafinitní chromatografie •různá uspořádání a průběh imunochemické reakce • • drogy těhotenský test • • • • • • • proužek drogy proužek hCG drogy Multiplexové metody princip Luminex •Imunosenzory • - citlivý prvek biologického • původu + elektronická • jednotka → výstupní signál Imunosenzor Imunohistochemie •vazba protilátek s antigeny ve tkáni Princip NIF NIF 2 NIF3 Děkuji Vám za pozornost… …sendvič ??? pozornost sendvičx sendvič 2