Miroslava Beňovská KLM LF MU Krevní barviva – porfyriny, hemoglobin, bilirubin Porfyriny lPoruchy metabolismu porfyrinů: lZískané (např. při otravě olovem) lS dědičným podkladem – porfyrie l lPorfyriny - tetrapyroly, prekurzory hemu l- Vznikají řadou na sebe navazujících reakcí l- První je tvorba kyseliny 5 - aminolevulové (ALA) z glycinu a sukcinátu katalyzovaná syntázou kyseliny 5 – aminolevulové - popsáno osm variat l- Druhým enzymem – porfobilinogensyntáza -vznik porfobilinogenu z 2 molekul ALA lPorfyrie - defekt tvorby kteréhokoliv enzymu syntézy porfyrinů za stupněm ALA l - vysoká koncentrace ALA typická lPředevším v kostní dřeni (pro tvorbu hemoglobinu), játrech (tvorba hemoproteinů, cytochromů P-450) http://www.reactome.org/figures/porphyrin_biosynthesis.jpg Porfyrie: lcharakterizovány hromaděním porfyrinů nebo jejich prekurzorů v některých tkáních lzvýšenou hladinou v plasmě či v erytrocytech l zvýšeným vylučováním porfyrinů nebo jejich prekurzorů stolicí nebo močí l lKlinické příznaky: lKožní, fotosenzitivita – absorpce světla v oblasti 400 nm, volné radikály poškodí kožní buňky lAkutní bolest v břiše a neurologické příznaky Porfyrie - koncentrace porfyrinů zvýšena - v erytrocytech - v játrech lSymptomatická jaterní porfyrie ( Porfyria cutanea tarda) lnejčastější, patří mezi jaterní porfyrie (poškození jater) lpři nedostatku uroporfirogen dekarboxylasy. Objevuje se v pozdějším věku. lAkutní intermitentní porfyrie – porucha přeměny porfobilinogenu a porucha metabolismu steroidů v játrech (hromadí se a indukují tvorbu syntázy ALA) lCelá řada dalších typů porfyrií lRozlišení typů - analýza porfyrinů nejčastěji v moči l - zřídka v plasmě, erytrocytech a stolici l - analýza enzymů - výjimečně, v ČR se provádí ve l VFN Praha (dehydratáza 5-aminolevulátu) Stanovení celkových porfyrinů Matouš B. a kol. Základy lék. chemie a biochemie. Galén Praha Chromatogram s píky jednotlivých porfyrinů ob1 Stanovení porfyrinů a jejich prekursorů l lKvantitativní stanovení lStanovení porfobilinogenu (PBG) v moči - spektrofotometricky: lReakce porfobilinogenu v kyselém prostředí s l p-dimetylaminobenzaldehydem lVznik červeného kondenzačního produktu lReferenční rozmezí: do 36 umol/l l l lStanovení 5-aminolevulátu v moči - HPLC: l5-aminolevulát se reakcí s acetylacetonem a formaldehydem převede na fluorescenční derivát lStanovení HPLC metodou s fluorescenčním detektorem lReferenční rozmezí: do 20 umol/l l lAnamnéza lPacient byl přijat pro podezření na porfyrii (poruchu syntézy hemu). Poslední dva roky se mu objevovaly pigmentové skvrny na rukou, byl vyšetřen na kožní klinice, kde na základě kožní biopsie vzniklo podezření na porfyrii. Laboratorně měl pacient opakovaně pozitivní porfyriny v moči. Za hospitalizace byla provedena jaterní biopsie a laboratorní diagnostika protilátek, pacient byl nadále sledován ambulantně. Byla mu doporučena abstinence a nevystavovat se přímému slunci. Test Výsledek (umol/24 hod) Ref. interval dU-Heptaporfyrin 4,180 0,0-0,014 umol/24 hod dU-Hexapporfyrin 0,420 0,0-0,006 umol/24 hod dU-Pentaporfyrin 0,493 0,0-0,005 umol/24 hod dU-Uroporfyrin 8,210 0,0-0,050 umol/24 hod dU-Koproporfyrin 1,100 0,0-0,280 umol/24 hod Výsledky pacienta s porfyrií – porfyria cutanea tarda Hemoglobin lČerveně zbarvená bílkovina obsažená v erytrocytech lPatří mezi konjugované bílkoviny - spojením bílkoviny s organickým komplexem obsahujícím kov lHemoglobin tvořen z hemu (protoporfyrin IX s navázaným Fe2+ ) a bílkoviny globinu lGlobin je tvořen 2 polypeptidickými řetězci a a dvěma řetězci b lMolekula ve tvaru čtyřstěnu lKaždý globinový řetězec je v jednom rohu, porfyrinové řetězce jsou umístěny v dutinách řetězců s atomem Fe uprostřed lMolekula sestává ze čtyř hemů, obsahuje 4 atomy Fe lU dospělých - hemoglobin tvořen z 96% HbA (a 2 b 2) lZ 2-3% HbA2 (obsahuje d řetězce a značí se a 2 d 2 ) lFetální hemoglobin (HbF) dominuje ve fetálním životě l - Během prvního roku života dítěte ubývá l - U dospělých asi 1%. l - Skládá se ze dvou a a dvou g řetězců Deriváty hemoglobinu lOxy-/deoxyhemoglobin – s navázaným O2 nebo bez navázaného O2 (železo ve formě Fe2+, v oxidované i neoxidované formě) lKarbaminohemoglobin – fyziologický komplex s oxidem uhličitým l (CO2 navázaný přes -NH2 konec β řetězce) lMethemoglobin – vzniká z hemoglobinu oxidací železa na Fe3+ l - Nemůže vázat kyslík, normálně konc. pod 1,5% l - Kongenitální methemoglobinémie - údržba Fe2+ narušena l nedostatkem NADH methemoglobin reduktázy (riziko l methemoglobinemie u dětí při pití vody s obsahem dusičnanů) l - Metabolická acidóza nebo kóma - zvýšení konc. methemoglobinu l - Hladiny nad 70% mohou být letální lKarbonylhemoglobin – vniká při otravách s CO reversibilní vazba CO, který se na Fe2+ váže asi 200-300x pevněji než O2) - hypoxie lSulfhemoglobin – Cyanóza (modravé až modrofialové zbarvení kůže a sliznic, které se objevuje při nedostatečném okysličení krve) z toxických příčin: sulfonamidy, nitrity, nitroglycerin, acetanilid; není známá léčba – zabránění intoxikaci, persistence po celou dobu života erytrocytů l l Talasémie, Hemoglobinopatie lHemoglobinopatie: lStrukturální abnormality jednoho či druhého globinového řetězce ( záměna aminokyseliny v řetězci). lVíce než 700 typů - většina se klinicky nemanifestuje lVíce než 100 druhů anemií má nestabilní a či b globinové řetězce – nestabilní hemoglobinová hemolytická anémie lSrpkovitá anémie - u homozygotů defekt tvaru erytrocytů, anémie, bolest kloubů, infarkt různých orgánů - S forma hemoglobinu ( záměna kys. glutamové za valin) l lTalasémie: lDědičné poruchy - změna poměru syntézy jednoho či druhého globinového řetězce la -talasémie (Afrika, jihovýchodní Asie) – redukce a řetězců lb -talasémie (Středomoří, Indie, jižní Čína) – redukce b řetězců lMnožství variant, kombinace talasémií lNěkdy bez klinických příznaků, jindy s výraznou anémií l §Spektrofotometrické měření – tHb i jeho deriváty mají charakteristická absorpční spektra ve viditelné oblasti záření l ⇒ typická výrazná absorpční maxima v oblasti 400–430 nm l (Soretův pás), další absorpční vrcholy jsou podstatně nižší § § Stanovení hemoglobinu lNejčastěji v plné krvi lStopy v séru, plasmě, moči a stolici - na základě pseudoperoxidázové aktivity - hem obsahující Fe2+ katalyzuje oxidaci některých barviv benzidinového typu peroxidem vodíku l lStanovení Hb v plné krvi s hexakyanoželezitanem (Drabkin) – l referenční metoda (dříve jako součást stanovení krevního obrazu,1966 mezinárodní standard, pomalá a nesnadno se automatizuje, toxický odpad): lHb se lyzačním roztokem (hypotonický pufr) uvolní z erytrocytů lHb + Fe (CN) 63- ® MetHb + Fe (CN)64- lMet Hb + CN- ® MetHbCN lVznik kyanidového komplexu, měří se fotometricky při 540 nm l Stanovení Hb v plné krvi lSoučást stanovení krevního obrazu (na hematologických automatech ): l - nejprve se přídavkem speciálního roztoku zlyzují erytrocyty l - pak se přidá transformační roztok – vzniká komplex lauryl sulfát sodný – Hb (Sysmex) nebo imidazol – Hb. l - vzniká opticky stálý komplex barevný komplex – stanoví se fotometricky l - metoda rychlá, netoxická, snadno se automatizuje, přesně měří i vzorky s obsahem methemoglobinu a kontrolní krve lV biochemii jako součást ABR analyzátorů - měření absorpce světla v plné krvi (využití rozptylu světla červenými krvinkami - světelným zdrojem je laser l l Referenční interval hemoglobinu v plné krvi l l lM 130-175 g/l lŹ 120-165 g/l l Stanovení derivátů hemoglobinu ( v plné krvi) lProvádí se na oximetrech -samostatné přístroje l - oximetrický modul součást přístrojů na ABR lDeriváty hemoglobinu - měří se spektrofotometricky na základě Lambert-Beerova zákona lStanovuje se celkový hemoglobin, oxyhemoglobin, karbonylhemoglobin, methemoglobin a sulfhemoglobin lK methemoglobinu i sulfhemoglobinu jsou rovněž popsány fotometrické metody l § §Stanovení derivátů Hb l l - oximetry jsou také součástí ABR analyzátorů l - spektrofotometrická stanovení při různých vlnových délkách l - využití charakteristických absorpčních spekter derivátů l l - oxy-/deoxyHb l - karbonylHb: stabilní maximálně 4 h l - metHb: Stanovení hemoglobinu lStanovení glykovaného hemoglobinu: lStanovení frakce HBA 1c zvýšené u diabetiků lMetodou HPLC na spec. přístrojích l lStanovení hemoglobinu ve stolici: lScreening na OK – viz. screeningová stanovení l lStanovení hemoglobinu v moči: lSoučást chemické analýzy moče s diagnostickými proužky Stanovení volného hemoglobinu v plasmě nebo séru lMetoda pro zjištění intravaskulární hemolýzy lHranice - nad 300 mg Hb/l patologická lŠetrný odběr - nádobka s heparinátem litným, stáčet při 2000ot/min l lRuční metoda: lAbsorpční spektrum při 340 – 600 nm, derivuje se l max. 403 – 405 nm l lMetoda na automatickém analyzátoru: lsemikvantitativní stanovení lvyužívá měření sérových indexů (hemoglobin, lipidy, bilirubin). lproměřuje se absorbance při šesti vlnových délkách (480, 505, 570, 600, 660 a 700 nm) Identifikace hemoglobinových variant l lDříve se používala elektroforéza lDnes dominují molekulární techniky, imunometody, HPLC, kapilární elektroforéza a MS Bilirubin lDoporučená rutinní metoda: Jendrassik – Gróf, fotometrické metody s DCA a DPD l lReferenční metoda: Doumas – Perry Bilirubin lLineární tetrapyrolové barvivo lVzniká z uvolněného hemoglobinu při rozpadu erytrocytů lNení jednotná látka - řada tetrapyrolů lErytrocyty zanikají a hemoglobin metabolizuje ve slezině lVznik biliverdinu, ten redukován na bilirubin lBilirubin vázaný na albumin transportován do jater lV játrech extrahován hepatocyty a navázán na kyselinu glukuronovou– stává se ve vodě rozpustným lKonjugovaný bilirubin vylučován žlučovými cestami do tenkého střeva. lTam redukce na další barevné produkty (urobilinogen, sterkobilinogen) lČást vstřebána zpět do jater - část vylučována močí a stolicí Konverze hemu na biliverdin a redukce biliverdinu na bilirubin 1 Hemová skupina, bilirubin 220px-Heme_b 200px-Bilirubin hem bilirubin Bilirubin- přímý a nepřímý lPřímý - dává po přidání směsi diazočinidel k séru přímo zbarvení lPřímý odpovídá bilirubinu konjugovanému - podíl, který již prošel játry, kde byl konjugován lBilirubin nepřímý – nerozpustný ve vodě, vázaný na albumin, dosud játry neprošel lNekonjugovaný je třeba uvolnit z vazby na albumin (kofein, benzoát sodný) lSérum nutno chránit před přímým světlem – pokles Referenční hodnoty lBilirubin celkový S/P: l dospělí do 20 umol/l l novorozenci 1den do 100 umol/l l novorozenci 2dny do 120 umol/l l novorozenci 3dny do 205 umol/l lBilirubin přímý S/P: l dospělí do 5 umol/l l U 0 arb. jednotek l Stanovení bilirubinu - historie lReakce bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou – Ehrlich v r. 1883 - současné metody z reakce vychází l Stanovení bilirubinu celkového a přímého s diazotovanou kyselinou sulfanilovou lMetoda Jendrassik – Gróf ( r. 1938): lCelkový bilirubin - po přídavku akcelerátoru - kofein + benzoát (Při stanovení bilirubinu konjugovaného se tento krok vynechá) lPřidat diazotovanou kyselinu sulfanilovou (činidlo z dusitanu sodného a kyseliny sulfanilové) lVznik červeně zbarveného azobilirubinu s abs. max. 440 nm (interferuje hemolýza) lModrá forma azobilirubinu – po 10 minutách k reakci přidat NaOH a vínan sodno-draselný - 600 nm, hemolýza nevadí lPři stanovení přímého bilirubinu reakci zastavit kyselinou askorbovou Kopulace bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou - tvorba azobilirubinu 3 Stanovení bilirubinu celkového s DPD lCelkový bilirubin v přítomnosti vhodného solubilizačního činidla kopuluje s diazoniovými ionty v silně kyselém prostředí lRychlá reakce dichlorofenyldiazonium tetrafluoroborátu (DPD) s bilirubinem - tvorba azobilirubinu l kyselina lBilirubin + diazoniový iont ----------> azobilirubin l lIntenzita červeného zabarvení je přímo úměrná celkovému bilirubinu a může být stanovena fotometricky lV praxi nejrozšířenější metoda lHemolýza ruší až od vysokých koncentrací hemoglobinu Stanovení bilirubinu l lEnzymové stanovení bilirubinu přes biliverdin: lOxidace bilirubinu kyslíkem na zelený biliverdin – s bilirubinoxidasou lMěří se pokles absorbance – 424 - 465 nm lBěžně se nepoužívá l lStanovení bilirubinu přímou spektrofotometrií u novorozenců: lAbsorbance se měří při 454 nm lMetoda nelze použít u starších - přítomnost karotenu a jiných pigmentů l l Interpretace biochemických nálezů lKámen žlučníku lJaterní selhání lVirová hepatitida lAlkoholismus lPorfyrie str.43