Průtoková cytometrie RNDr. Alena Mikušková FN Brno – Pracoviště dětské medicíny, OKB dětská nemocnice Průtoková cytometrie – Flow Cytometry §technika pro kvalitativní a kvantitativní analýzu buněk nebo jiných částic (jadérka, mikroorganizmy, latexové částice aj.) v suspenzi §rozlišení buněk pomocí rozptylu světla a fluorescence §rozlišení na základě fyzikálních a chemických vlastností buněk •např. velikost, množství granul, obsah DNA, apod. §po označení buněk fluorescenčním konjugátem monoklonálních protilátek umožňuje studium •povrchových molekul •diferenciačních antigenů •intracelulárních molekul apod. §průtokový cytometr •vyhodnocuje řádově tisíce buněk za sekundu buňky Princip průtokové cytometrie §buňky v suspenzi protékají kapilárou - usměrněné do velmi tenkého proudu §buňky protínají dráhu paprsku světla (laseru) kolmého na směr toku §buňka rozptyluje světlo do různých směrů •podle své velikosti •vnitřní struktury (granulace) §vyhodnocením rozptylu lze buňky roztřídit na jednotlivé buněčné populace •př. lymfocyty, monocyty, granulocyty §Fluorescence: •buňky před analýzou obarveny fluorescent. barvivem •nebo inkubovány s fluorescenčně značenými monoklon. Ab proti určitým Ag •excitace fluorochromů laserem •následná emise fluorescenčního záření •fluorescence odráží •vnitřní strukturu buňky •specifické molekuly exprimované na povrchu buňky (znaky, receptory) •umožňuje třídění buněk do subpopulací schema cytometru bez sorteru Průtokový cytometr - schema •rozptýlené světlo a emitovaná fluorescence rozděleny optickou soustavou •hranoly, filtry, zrcadla •detekce –FSC…detektor rozptylu světla v malém úhlu –SSC…detektor bočního rozptylu –PMT…fotonásobiče (detektory fluorescence) •FACS Calibur (Becton-Dickinson) •(Fluorescence Activated Cell Scanner) schema FC (ABD Serotec) cytometrysimplify FACSCalibur (Becton-Dickinson) Průtokový cytometr - fluidní systém •hydrodynamická fokuzace •vzorek (suspenze) vnášen tenkou tryskou do průtokové kyvety (silnější kapilára) •kapilárou proudí nosná tekutina (solný roztok, tzv. Sheath fluid) •laminární průtok nosné tekutiny usměrní buňky do velmi tenkého proudu –částice se pohybují v jedné řadě za sebou fokuzace hydrodynamická fokusace Fluidní systém akustická fokuzace • alternativní způsob usměrnění buněk • využívá ultrazvukové vlny pro umístění buněk do osy kapiláry akustická fokuzace Průtokový cytometr optický systém •zdroj světla –laser, např. Ar (488 nm), He - Ne (635 nm) –rtuťová nebo xenonová lampa •optická soustava pro rozdělení rozptýleného světla resp.fluorescenčního záření podle vln. délky –dichroická zrcadla •odráží světlo určité vlnové délky, jiné propouští –filtry - propouštějí pouze určité vlnové délky Fotonásobiče2 schema FC (ABD Serotec) •detektory –diody (FSC a SSC) –fotonásobiče (PMT – photomultiplier tube) •zachycují fluorescenci pro každý fluorofor zvlášť v úhlu 90 st. od osy laserového paprsku short pass long pass band pass filtry2 Základní parametry flow cytometrické analýzy §Forward scatter channel – FSC (rozptyl světla v malém úhlu) –dioda měří signál v malém úhlu od osy paprsku –intenzita signálu přímo úměrná velikosti buněk – – – §Side scatter channel – SSC (boční rozptyl) –fotonásobič v úhlu 90 st. od osy laser. paprsku –informace o vnitřní struktuře buněk (granulace) –FSC + SSC - identifikace buněk v suspenzi §Fluorescence - FL –informace o vnitřních strukturách buňky –o specifických membránových resp. cytoplazmatických molekulách FSC, SSC FSC 2 FSC, SSC2 cytometr Flow cytometr – vyhodnocovací systém §Světelné signály převedeny na elekrické impulzy • •Zpravidla se měří „plocha“ elektrického signálu (integrál) • •Jiná možnost zpracování signálu - měření výšky a šířky signálu pro odlišení agregátů buněk – – – §Elektrické signály zpracovávány počítačem •digitalizace, grafické znázornění • §Počítačové zpracování dat umožňuje tzv. gatování (elektronická selekce analyzovaných částic) FC záznam pulzu výška a plocha impulsu Zobrazování dat z flow cytometrické analýzy •Výstup - výsledky v číselné nebo grafické formě •Grafické zobrazení: •jednoparametrové histogramy –osa x …intenzita signálu FSC, SSC nebo FL –osa y … četnost buněk •dvouparametrové grafy –osa x … intenzita jednoho měřeného parametru –osa y … intenzita druhého parametru –množství buněk je znázorněno •hustotou bodů (tzv. dot-plot histogram) •vrstevnicemi (contour-plot histogram) •barvami znázorňujícími hustotu (density plot) •Archivace dat –ve formě histogramů –ve formě souborů, které uchovávají všechny údaje o každé buňce 3D jednoparametrový histogram plots Zobrazování dat z flow cytometrické analýzy • scattergram Historie průtokové cytometrie •Counter (počítač buněk) –1953, USA, bratři Coulterové •impedanční princip: –buňky usměrněné hydrodynamickou fokuzací ve vodivém roztoku –prochází mezi elektrodami (stejnosměrné napětí, proud) –při průchodu buňky pulzní zvýšení el. odporu (impedanční pulz) –počet impulzů … počet prošlých buněk –velikost impulzu … objem buňky •původní Coulter princip - stále používaný v hematologii - analyzátory pro počítání krevních buněk –kombinace s dalšími technologiemi - rozptyl, fluorescence •1968 - fluorescenční flow cytometr –první flow cytometry byly přístroje pouze experimentální –původní název metody - „pulzní cytofotometrie“ První Coulter starý cytometr Hematologické analyzátory pro počítání krevních buněk • Stanovení počtu jednotlivých typů krvinek na principu průtokové cytometrie §počet erytrocytů (RBC – red blood cell), §počet trombocytů (PLT - platelet), §počet a morfologický typ leukocytů (WBC – white blood cell): •polymorfonukleáry (granulocyty) –neutrofilní –eozinofilní –bazofilní •mononukleáry –lymfocyty –monocyty §a další (retikulocyty, Hb,…) –Princip stanovení na hematologickém analyzátoru –- krev rozvedena do tří cest: 1.erytrocyty a trombocyty - impedanční metoda 2.hemoglobin - spektrofotometrie v průtokové cele 3.neutrofily, eozinofily, bazofily, lymfocyty, monocyty • - různé principy stanovení – dle výrobce WBC schema hem analyzátoru Příklady technických řešení stanovení leukocytů •Beckman Coulter •Elektrooptická flow cytometrie VCS (V – volume, C –conductivity, S – scatter) §destrukce erytrocytů a trombocytů lyzačním činidlem §leukocyty zůstávají konstitučně neporušeny - detekce •impedanční metodou (počet a objem buněk – V) •vysokofrekvenčním střídavým el. polem (vnitřní struktury buněk - nevedou el. proud – C) •rozptylem laserového paprsku (tvar buňky, povrch – S) §měření všech tří parametrů simultánně na každém leukocytu §softwarové zpracování •roztřídění buněk do skupin •zobrazení – histogram Impedanční princip (Coulter) •počet buněk • • • COULTER® Ac·T diff™ Analyzer Coulter princip beck - col Příklady technických řešení stanovení leukocytů •Sysmex §optická metoda – fluorescenční průtoková cytometrie §pro měření leukocytů - dva měřící systémy (kanály): –1. systém - měření neutrofilů, eozinofilů, monocytů a lymfocytů •destrukce erytrocytů a trombocytů lyzačním činidlem •perforace membrány leukocytů •obarvení DNA a RNA v jádře i cytoplazmě – fluorescenční barvivo •navázání organických kyselin z lyzačního činidla na eozinofilní granula –zvýšení signálu - odlišení eozinofilů od neutrofilů •expozice polovodičovým laserem –SSC odpovídá lobularitě, tj. členitosti jádra a přítomnosti granulí v cytoplazmě –fluorescence odpovídá množství nukleových kyselin –2.systém - měření bazofilů •destrukce všech buněk kromě bazofilů druhým lyzačním činidlem –z ostatních WBC zůstávají jen holá jádra –FSC - velikost částice –SSC - vnitřní struktura Příklady technických řešení stanovení leukocytů • Sysmex • • • • • • • • XE-2100™ Automated Hematology System •XE-5000™ Automated Hematology systém Sysmex analyzátor Scattergram ze Sysmexu Scattergram ze Sysmexu baso sysmex scattergram2 Sysmex analyzátor 2 Příklady technických řešení stanovení leukocytů •Abbott •MAPSS technologie (Multi Angle Polarized Scatter Separation) •interakce buněk s polarizovaným paprskem argonového laseru •rozptýlené světlo měřeno v různých úhlech •v kolmém směru sledována míra depolarizace paprsku buňkou •buňky rozlišeny na základě rozptylu světla •odlišení eozinofilů (od neutrofilů) na základě schopnosti depolarizovat světlo •Optický systém analyzátoru CELL-DYN 4000 •Polarizovaný paprsek Ar laseru zrcadly usměrněn do průtokové cely •Interakce buněk s paprskem •detektor „buvolí oko“ - detekce rozptylu světla pod úhlem 0 a 7 st. •3 fotonásobiče – detekce –depolarizované rozptýlené světlo z eozinofilů –rozptýlené světlo pod úhlem 90 st. –příp. fluorescence Cell Dyn Abbott Abbott cell Dyn foto Příklady technických řešení stanovení leukocytů •Abbot •ALL - úbytek světla pod úhlem 0° - velikost buňky (měřeno ve středové části detektoru) –srovnání intenzity paprsku při průchodu buněk s plnou intenzitou paprsku za nepřítomnosti buněk •IAS - rozptýlené světlo pod úhlem 7° - komplexita buňky (měřeno ve vnější části detektoru) •PPS - rozptýlené světlo měřené pod úhlem 90° - členitost buněčného jádra (lobularita) •DPS - rozptýlené depolarizované světlo měřené pod úhlem 90°- granularita a odlišení eozinofilů od neutrofilů –granula obsažená v eozinofilech světlo při rozptylu depolarizují • neutro - eos Abbott mono poly Abbott Abbott scattergram Příklady technických řešení stanovení leukocytů •Siemens §cytochemická tzv. Perox metoda §buňky cytochemicky obarveny na přítomnost intracelulární myeloperoxidázy §interakce buněk se světlem wolframové žárovky v průtokové cele §hodnocení: –velikost (objem) buňky - rozptyl světla –myoperoxidázová aktivita buněk – absorpce světla •neutrofily, monocyty a eosinofily – pozitivní na myeloperoxidázu •lymfocyty a bazofily – negativní na myeloperoxidázu –scattergram s vyznačením klastrů (oblastí pro jednotlivé populace) – » •1,2,3…šum, RBC, PLT •4…lymfocyty a bazofily Siemens Advia 120 •5…velké nebarvitelné buňky •6…monocyty •7…neutrofily •8…eozinofily siemens advia Flow cytometrie v močové analýze •Analyzátory močového sedimentu UF (Sysmex) •Principy - impedanční měření, rozptyl světla a fluorescence •RBC, WBC, epitelie, hyalinní válce, patologické válce, bakterie, kvasinky, spermie, krystaly a „jiné buňky“ • •necentrifugovaná moč naředěna dilučním pufrem - stabilizace osmotického tlaku •obarvení vzorku dvěma fluorescenčními barvivy –membrány (karbocyanin) –nukleové kyseliny (fenantridin) •hydrodynamická fokuzace Sysmex UF-100 •impedanční měření (objem buňky) •průchod částic paprskem Ar laseru (488 nm) –intenzita FSC (velikost částice) –šířka FSC pulzu (délka částice) –SSC (povrch částice) –intenzita fluorescence (odráží barvitelnost) –šířka pulzu fluorescence (délka obarvené části) •zobrazení pomocí scattergramů UF Sysmex Flow cytometrie v močové analýze •Scattergram malých částic •Závislost intenzity FSC signálu (velikost částic – Size of Cell) na intenzitě fluorescence (barvitelnost částice - Stainability) • • •Scattergram velkých částic •Závislost šířky signálu fluorescence (délka obarvené části – Lenght of Stained Area) na šířce FSC signálu (délka částice – Lenght of Cell) •epitelie •válce hyalinní (without inclusions) •válce patologické (with inclusions) ▼nemožnost kvalitativního popisu položek, rozpoznání zřídka se vyskytujících komponent ▲možnost diferenciální diagnostiky hematurií na základě distribuční křivky erytrocytů a jejich morfologie, příp. analýzy jiných tělních tekutin (mozkomíšní mok, …) moč - malé částice moč - velké cástice Flow cytometrie - buněčná imunologická vyšetření •Buňky imunitního systému Buněčné populace Flow cytometrie - buněčná imunologická vyšetření •CD klasifikace - jednotný systém pro označování diferenciačních znaků •buněčné subpopulace na povrchu exprimují specifické molekuly (znaky, receptory) –struktura - glykoproteiny •znaky - pro jednotlivé subpopulace typické •skupiny znaků charakterizují –buněčnou linii –stav diferenciace buňky –aktivaci buňky… •každý znak definované struktury označen číslem, např. CD1. CD2, CD3, atd. – Cluster of Differentiation •každý nově objevený znak dostává další pořadové číslo –pořadové č. neříká nic o struktuře znaku •v současné době charakterizováno již víc než 400 takových znaků CD znaky CD Flow cytometrie - buněčná imunologická vyšetření •Imunofenotypizace leukocytů průtokovou cytometrií •zjišťování povrchových molekul (CD znaků) –některé společné pro více druhů leukocytů - zajišťují společné základní funkce –jiné přítomné specificky pouze na určité subpopulaci •Princip: •Inkubace buněk v plné krvi s monoklonální protilátkou proti vyšetřovanému CD znaku –protilátka označena fluorescenčním barvivem (přímá fluorescence) –buňky lze označit současně více fluorochromy – detekce více znaků najednou •vazba protilátky na buněčnou strukturu vyhodnocována průtokovou cytometrií •počítačové zpracování naměřených dat - tzv „gatování“ (elektronické ohraničení) –lze získat údaje o subpopulaci buněk charakterizovaných na základě jiného znaku •např. zastoupení znaku CD4 na CD3 pozitivních buňkách –(CD3 je typický pro T-lymfocyty, kombinace CD3 a CD4 signálu z nich vyselektuje Th lymfocyty) gatování Imunofenotypizace leukocytů průtokovou cytometrií •Reagencie a postupy •fluorescenčně značené monoklonální protilátky –přímá imunofluorescence •protilátka proti zkoumanému antigenu je označená fluoroforem •výhodou přímé fluorescence je jednodušší zpracování vzorku –nepřímá fluorescence •protilátka proti zkoumanému antigenu není značená •k její detekci se používá značená protilátka proti této protilátce –pokud neexistuje Ab (proti zkoumanému Ag) ve formě konjugátu s fluorochromem –sledování slabě exprimovaného antigenu (nepřímá FL - intenzivnější signál) •fluorochromy pro značení Ab – samostatné - tandemové (excitace primárního aktivuje sekundární fluorochrom) fluorochromy fluorochromy tandemové Imunofenotypizace leukocytů průtokovou cytometrií •Reagencie a postupy •reagencie pro fixaci, lyzaci RBC nebo permeabilizaci membrán leukocytů –permeabilizace - šetrné poškození membrány (zprůchodnění pro reagencie) •vyšetřování cytoplazmatických nebo jaderných antigenů •vyšetřování obsahu buněčné DNA a RNA atd. •Kvantimetrie - určení množství (intenzitu exprese) antigenu na jednotlivých buňkách na základě množství navázané protilátky –srovnání signálu buněk s kalibrační křivkou –kalibrační částice - kuličky se známým množstvím navázaného fluorochromu •použití času jako jednoho z parametrů - lze provádět i kinetické studie –např.měření změn hladin intracelulárního kalcia, stanovení aktivity intracelulárních enzymů… kvantimetrie Flow cytometrie - buněčná imunologická vyšetření •Přístroje •flow cytometry se složitým optickým systémem –více laserů a detektorů pro fluorescenci různých vlnových délek) •možnost softwarové kompenzace překryvu emisních spekter fluorochromů –při multibarevné analýze •cytometr se „sorterem“ - zařízení pro třídění buněk do frakcí –fokuzovaný proud buněk prochází vibračním mechanismem •rozpad proudu na jednotlivé kapičky •každá obsahuje pouze jednu buňku –po průchodu paprskem buňkám udělován el. náboj (+ nebo -) –nabité buňky rozděleny do sběrných zkumavek elektrostaticky •pomocí nabitých vychylovacích destiček –Calibur Becton–Dickinson, iCyt Eclipse, Partec CyFlow aj. fluorochromy a filtry schema cytometru orez Flow cytometrie - multiplexové metody –Flow cytometrie - dokáže detegovat jakékoli částice velikosti řádově v μm •např. inertní mikrosféry (kuličky) obarvené různými fluorochromy –viz kalibrace flow cytometrů (kvantimetrie) • •Multiplexové systémy - stanovení velkého počtu analytů z minimálního objemu vzorku –planární, které jsou vlastně rozšířením ELISA metody –„bead-based“ multiplex. analýzy (na mikrosférách) - zpracovávané flow cytometrií •inertní polystyrenové mikrosféry (kuličky, beads) obarvené různými fluorochromy –pevná báze pro multiplexové analýzy princip Luminex Flow cytometrie - multiplexové metody • –mikrosféry obarveny dvěma fluorescenčními barvivy •kombinace - až 500 různých barevných odstínů (typů) mikrosfér –na každém typu mikrosféry navázaná specifická protilátka nebo proba rozpoznávající a vázající určitou molekulu •antigen, protilátka, receptor, substrát enzymu, DNA, RNA atd. •smísení mikrosfér se vzorkem •specifické navázání příslušného analytu ze vzorku na povrch mikrosféry •přidání fluorescenčně značené protilátky proti navázanému analytu •vyhodnocení suspenze flow cytometrií –registrace zbarvení vlastní mikrosféry (identifikace navázaného analytu) –kvantifikace analytu na základě intenzity fluorescence značené protilátky princip Luminex Flow cytometrie - multiplexové metody •Luminex xMAP (Multiple Analyte Profiling) –teoreticky umožňuje 50 – 500 simultánních analýz –Luminex dodává řada firem, např. Applied Cytometry System, BioRad, Invitrogen, Millipore a další. –systém Luminex vyžaduje speciální flow cytometry •CBA (Cytometric Bead Array) firmy BD Bioscience –dovoluje simultánní stanovení 30-ti analytů –lze provádět na jakémkoli multibarevném flow cytometru •Beckman Coulter –místo kombinace dvou barev na mikročástici využívá kombinaci dvou mikrosfér pro každou metodu – •Aplikace: - cytokiny - chemokiny - růstové faktory »- zánětlivé markery - kardiální markery - tumormarkery »- hormony - specifické IgE - izotypy imunoglobulinů »- protilátky - fosfoproteiny - intracel. signální molekuly »- HLA testování - genotypizace - a další Děkuji za pozornost… pozornost ???