KLINICKÁ MIKROBIOLOGIE- SHRNUTÍ Markéta Hanslianová Masarykova univerzita Katedra laboratorních metod •Dotazy k prezentaci: • •109293@mail.muni.cz • • Klinická mikrobiologie •Zajišťuje diagnostiku infekčních onemocnění vyvolaných baktériemi, viry, parazity a mykotickými agens •Stanovuje citlivost/rezistenci mikrobiálních agens k antimikrobiálním látkám •Ve spolupráci s klinickými lékaři poskytuje konzultace mikrobiologického nálezu a antimikrobiální terapie •Správný výsledek mikrobiologického vyšetření začíná správným odběrem biologického materiálu a jeho rychlým transportem do mikrobiologické laboratoře •Výtěr z krku vAMIES •Vyšetření na toxin Clostridium difficile vKusová (tekutá) stolice •PCR vyšetření vSuchý tampon •Vyšetření biologického materiálu •Stanovení pravděpodobného původce infekce •Stanovení citlivosti k antibiotikům • Vyšetření biologického materiálu •Mikroskopie •Kultivace •Průkaz antigenů •Průkaz metabolitů (Helicobacter pylorii -ureáza) •Průkaz nukleových kyselin (PCR) •Průkaz protilátek (nepřímý průkaz) Mikroskopie vNativní preparát •Trichomonas vaginalis vBarvený preparát •Barvení dle Grama •Barvení dle Giemsy •Barvení dle Ziehl- Nielsena •Barvení spor •Barvení pouzder •Fluorescenční barvení • • Barvení podle Grama •Hans Christian Joachim Gram, 1884 •Dělí bakterie do dvou základních skupin • •Grampozitivní G +, modrofialové •Gramnegativní G -, růžovočervené • Dánský bakteriolog, odlišnost buněčné stěny G+ a G- baktérií Barvení podle Grama C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\P1010227.jpg Barvení podle Grama- význam •Diagnostické barvení – základ klasifikace a taxonomie bakterií •Možnost okamžité a racionální antibiotické terapie (mikroskopie pozitivních hemokultur, sputa) Mikroskopie hemokultur, sputa Fluorescenční barvení •Pomocí fluoreskujícího barviva •Imunofluorescence •Na hledaný antigen se naváže protilátka označená fluoreskujícím barvivem •Pozorování pomocí fluorescenčního mikroskopu •Mikroskopie- parazitologické vyšetření Kultivační průkaz •Základní mikrobiologický postup •Cílem je: • üZískat mikroba z klinického materiálu v čisté kultuře üIdentifikovat ho üUrčit citlivost k antibiotikům • •Kultivační půdy (tuhé, tekuté, diagnostické, selektivní, selektivně diagnostické…) • •Očkování biologického materiálu • •Diagnostická antibiotika • •Kalibrované kličky Kultivační půdy vTekuté:masopeptonový bujon vTuhé: •Krevní agar •Čokoládový agar •Levinthalův agar •Mac Conkey agar (Endova půda) •Sabouraudův agar • • Podmínky kultivace •Dostatečná vlhkost prostředí •Optimální teplota - 37° C (4° C, 40° C) •Optimální pH půdy – 7,2 – 7,4 •Dostatek vhodných živin •Vhodné plynné prostředí (aerobní, anaerobní, mikoraerofilní kultivace) Jmenovat nějaké anaerobní baktérie Anaerostat P1010162 Identifikace bakterií •Podle morfologie •Podle růstových vlastností •Podle biochemických vlastností •Selektivní půdy •Komerční diagnostické soupravy •Podle antigenní struktury •Latexová aglutinace •Hmotnostní spektrometrie (MALDI) • • • http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/rep/graphics/clump1.jpg Identifikace bakterií- morfologie a růst •Typický růst některých baktérií •Morfologie kolonií •Hemolýza PSAE, STAU, STPN MacConkey agar a krevní agar nárůst E.coli ESCO- izolace na KA+McC Identifikace bakterií- MALDI •Výhody hmotnostní spektrometrie (rychlost) •Úskalí dokonalé identifikace Identifikace bakterií- biochemie P1010151 •Většinou nahrazeno MALDI •V některých případech ale nutné (E.coli x Shigella) Identifikace bakterií- průkaz antigenů •Latexová aglutinace •Rychlá vyšetřovací metoda • Identifikace - průkaz antigenů •Mykologie- stanovení antigenů hub pomocí ELISA •Galaktomanan (aspergilový antigen) •Glukan (panfungální antigen- vysoká negativní prediktivní hodnota) • Kultivace- hodnocení •Nález primárního patogena- většinou jednoznačná situace (Neisseria gonorrhoeae) • •Nález oportunního patogena- nutné informace o pacientovi a komunikace s klinikem!! • častější situace •Stanovení citlivosti agens k antibiotikům •Disková difúzní metoda •Stanovení hodnot MIC antibiotika vůči danému mikroorganismu •Semikvantitativní metody (mykoplazmata, ureoplazmata) Stanovení citlivosti k antibiotikům •Disková difúzní metoda •Difuze antibiotik z disků do půdy a potlačení růstu baktérií •Srovnání se standardy •Vyhodnocení a zařazení • do kategorií C/I/R Stanovení citlivosti k antibiotikům •Diluční testy •Stanovení koncentrace antibiotika, která potlačuje růst mikroba (MIC) •Srovnání se standardy •Vyhodnocení a zařazení • do kategorií C/I/R • Stanovení MIC– E-test C:\Users\Martin\Documents\mikrobiologie\P1010087.JPG Diagnostika virových infekcí 1.Přímá- , mikroskopie, tkáňové kultury, průkaz antigenu, nebo nukleové kyseliny viru 2. 2.Nepřímá- průkaz protilátek Přímý průkaz viru •Mikroskopický průkaz- elektronový mikroskop • •Izolace viru na tkáňových kulturách- pěstování viru na kulturách buněk (opičí ledviny)- cytopatický efekt Průkaz nukleových kyselin viru •polymerázová řetězová reakce •přímý průkaz NK virů (bakterií, kvasinek, parazitů) •různé modifikace •výhody: vysoká specificita, rychlost, ATB nejsou kontraindikací vyšetření •nevýhody: vysoká cena, přístrojové vybavení, riziko kontaminace Průkaz protilátek •Průkaz odezvy makroorganismu na infekční agens •Používané také u obtížně kultivovatelných baktérie (chlamydie, borélie) • • Dotaz- co je ELISA? Přehled serologických metod 1.Precipitace 2.Aglutinace 3.Komplement fixační reakce (KFR) 4.Neutralizace 5.Reakce se značenými složkami: • - imunofluorescence • - enzymová imunoanalýza • - Western blot (imunoblot) • • • •Klinická mikrobiologie- poskytuje servis vyšetření klinickým lékařům v úzké spolupráci s nimi!! •Stanovuje různými metodami původce daného onemocnění •Konzultace mikrobiologického nálezu •Konzultace antibiotické terapie •Rychlost, kvalita • •Vzájemná komunikace!! Kasuistika • •Pacient VCH, 1960 •Přijatý v březnu 2015 pro bolesti zad, crp 275, leukocytóza, febrílie •Paraplegik po autonehodě, kovový materiál na rozhraní Th a L páteře •Bolesti zad: ØRanná infekce ØSpondylodiscitida ØInfekce ledvin ØInfekce v dutině břišní (pankreas) ØInfekce v malé pánvi (gynekologické infekce) •Paraplegik po autonehodě, kovový materiál na rozhraní Th a L páteře • •Odběr biologického materiálu: ØHemokultivace ØMoč Ø BactAlert 1 • •Diagnostikována spondylodiscitida v oblasti Th páteře •Hemokultura •Empirická antibiotická terapie •Původce? • Staphylococcus aureus představuje nejčastější mikrobiální agens vyvolávající spondylodiscitidu. Lze jej předpokládat zejména u spondylodiscitid anamnesticky spojených se stafylokokovou infekční endokarditidou, u pacientů s předchozí katétrovou infekcí krevního řečiště, nebo infekcí kůže a měkkých tkání v anamnéze. Rizikovou skupinu pro spondylodiscitidu vyvolanou Staphylococcus aureus představují také nitrožilní narkomani. U pacientů s touto předpokládanou etiologií je pro empirickou terapii doporučený oxacilin v kombinaci s gentamicinem. •Anamnéza: • ØInfekční fokus (kariézní chrup, abscesy, IE…) ØPředchozí infekce (infekce spojené se zavedením CVK, uroinfekce, jiné infekce spojené a bakterémií…) •Anamnéza: Ø11-12/2014 hospitalizován pro absces v ledvině ØNefrektomie ØRevize pro krvácení do lůžka po ledvině Ø11/2014 pozitivní hemokultura s nálezem Klebsiella pneumoniae s ESBL produkcí •Vstupně nasazený potencovaný aminopenicilin (Augmentin) •Pro vysokou suspekci na klebsielovou etiologii spondylodiscitidy doporučena terapie meropenemem •Monoterapie- solitární ledvina s horší funkcí, kreatinin 370 umol/l, alergie na ciprofloxacin •Kultivace: půdy, inokulum, antibiotické disky •Atmosféra, doba kultivace •Hodnocení: identifikace mikroorganismu a stanovení citlivosti •Pozitivní hemokultura s nálezem Klebsiella pneumoniae s ESBL produkcí •Ponechána terapie meropenem + přidaný amikacin v redukovaných dávkách •Pokles hodnot crp i leu, • stabilizace stavu •Délka terapie? •Perorální pokračování terapie? •P.o. tetracyklin? •OPAT?- zatím ne v ČR •Hospitalizace pokračuje….. 1582 •Opakovaná antibiotická konzultace po hospitalizaci v jiném ZZ ØPacient s crp opět 270, zhoršení stavu ØKlindamicin v terapii osteomyelitidy v kombinaci s amikacinem ØPo CDI (Clostridium difficile) ØKl.pneumoniae ESBL ze sputa ØMRSA z hrudních drénů ØPolyrezistentní Pseudomonas aeruginosa z moči Ø •Původce spondylodicitidy není S.aureus, tedy zbytečný klindamycin •Riziko clostridiové kolitidy •Amikacin není vhodný v monoterapii plicních infekcí •Amikacin není vhodný v monoterapii stafylokokových infekcí • •Opět doporučený do terapie meropenem •Výhled pacienta? • •Klinická mikrobiologie – spolupráce mikrobiologa s klinickým lékařem •Na konci/ na začátku každého mikrobiologického vyšetření je nemocný člověk Děkuji za pozornost confused