Lékařská mykologie Iva Kocmanová •…houbové infekce kůže a kožních adnex jsou čtvrtou nejčastější lidskou zdravotní komplikací (po zubních kazech, vysokém tlaku a migréně)… • •vaginální kandidóza cca 75 mil. •chronické aspergilózy cca 6 mil. • •kryptokoková meningitida cca 1 mil. •pneumocystová pneumonie cca 400 tis. •invazivní kandidóza cca 400 tis. •invazivní aspergilóza cca 200 tis. • •/za rok • Prolog zdroj: WHO Úvod Houby jsou organismy eukaryotní (pravé jádro; mitochondrie), jednobuněčné i vícebuněčné, heterotrofní, buněčná stěna složená z polysacharidů (chitin; glukan; galaktomanan; manan etc.) Mykologie nauka o houbách (řec. mykes, lat. fungi) Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1.Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 1. Morfologie; základní pojmy Hyfa: houbové tělo bez ohledu na diferenciaci Mycelium: jen vegetativní část, žádný reprodukční orgán, zajišťuje výměnu látek a energie mezi houbou a prostředím Reprodukční struktury: sporangiofory, konidiofory, stromata, plodnice, mikrokonidie, makrokonidie, blastokonidie etc. 1. Rozmnožování hub anamorfa (nepohlavní stadium) + teleomorfa (pohlavní stadium) = holomorfa ANAMORFA A TELEOMORFA Penicillium repens (anamorfa) a Eurotium repens (telemorfa) - zdroj:www.myko.cz meióza (spory) mitóza (konidie) 1. Názvosloví hub •složité, pořád se měnící (genetika + názorové střety systematiků J) •většina medicínsky významných hub se vyskytuje jako anamorfa (nepohlavní stadium) Candida krusei Issatchenkia orientalis Scedosporium apiospermum Pseudoallescheria boydii Penicillium Eupenicillium, Talaromyces Aspergillus Eurotium, Emericella, Petromyces, Neosartoria anamorfa teleomorfa 1. Názvosloví hub Penicillium Eupenicillium, Talaromyces Aspergillus Eurotium, Emericella, Petromyces, Neosartoria anamorfa teleomorfa …ale – „one fungus – one name“ International Code of Nomenclature for algae, fungi, and plants (Melbourne Code) adopted by the Eighteenth International Botanical Congress Melbourne, Australia, July 2011. a) kvasinky a jim podobné •mikroskopicky kulaté nebo protáhlé buňky, 3-6 x 3-15 µm •obvykle nepohlavní rozmnožování pučením a dělením •na pevných půdách kolonie podobné bakteriálním rody Candida, Trichosporon, Cryptococcus etc. 1. …mezitím v klinické praxi Textové pole: • • • b) vláknité houby (plísně) •složeny ze soustavy hyf (mycelium) jednobuněčné/mnohobuněčné •obvykle nepohlavní rozmnožování rozrůstáním hyf, nebo vegetativní „spory“ •na pevných půdách vláknité povlaky rody Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Alternaria, Trichophyton, Microsporum etc. c) dimorfní houby •růst ve dvou formách (kvasinkové a vláknité) v závislosti na teplotě •importované (endemické) mykózy (Severní i Jižní Amerika, Dálný Východ) • rody Histoplasma, Blastomyces etc. d) ty, co se nikam nevešly •přeřazeny z parazitů díky studiu genomu •nekultivovatelné (nebo obtížně) Pneumocystis jiroveci, Microsporidium spp. etc. 1. …mezitím v klinické praxi D:\Dokumenty\Mykologie\studenti\1_mikroskopie\17_Pneumocystis_3_jpg.jpg Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 2. Patogeneze mykóz Textové pole: • • • Houby až na výjimky (dermatofyta, endemické mykózy) nejsou primárně patogenní (mohou kolonizovat kůži i GIT…), ale jsou oportunními patogeny ke vzniku onemocnění napomáhá přítomnost nějaké predispozice hostitele, tj. rizikové faktory (např. onkologická onemocnění a jejich léčba, léčba kortikoidy, diabetes, pobyt na JIP, nezralí novorozenci – ale i léčba antibiotiky, vlhká zapářka apod) 2. Dělení mykóz Lokální (povrchové, slizniční) infekce infekce kůže, kožních adnex a sliznic (dermatomykózy a kandidózy) Celkové, neboli invazivní infekce sepse (nejč.kandidové), pneumonie (nejč.aspergilové), diseminované mykózy Mykotoxikózy obvykle alimentární otravy způsobené toxiny hub (Claviceps purpurea, Aspergillus etc.), které kontaminují potravu (ergotismus-námel, aflatoxiny..) Alergická onemocnění přecitlivělost na části hub (konidie, části hyf..) Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 3. Antimykotika dle chem. struktury •alyeny (amfotericin a jeho lipidové formy, nystatin) • •azoly (flukonazol, itrakonazol, vorikonazol, clotrimazol, isavukonazol..) • •echinokandiny (caspofungin, micafungin, anidulafungin) • •antimetabolity (flucytosin) • •alylaminy (terbinafin) • •ostatní (k.undecylová, ciclopiroxolamin) Medical Mycology: The Last 50 Years 5-FC Miconazole Ketoconazole Fluconazole Itraconazole L-AmB ABCD ABLC Terbinafine # of drugs Denning, 2002 3. Alyeny Ergosterol Amphotericin B, jeho lipidové formy, nystatin Binding to ergosterol, Intercalation of cell membrane K+ Na+ Ca++ Ca++ Na+ K+ Leakage of intracellular cations and proteins nefrotoxické Princip – změna permeability buněčné membrány Cell membrane Ergosterol Azoly (flukonazol, vorikonazol, posakonazol..) Squalene Ergosterol Synthesis Pathway Toxic sterols Accumulation of toxic sterols in cell membrane Inhibition of 14-alpha-demethylase hepatotoxické, mnoho interakcí 3. Azoly Princip – inhibice syntézy ergosterolu (cytochrom P450) Mannoproteins ß(1,6)-glucan ß(1,3)-glucan Chitin Phospholipid bilayer of cell membrane ß(1,3) glucan synthase glucan synthase inhibitor Inhibition of ß(1,3) glucan synthase takřka bez nežádoucích účinků, drahé 3. Echinokandiny Princip – inhibice syntézy glukanu Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy 4. Vyšetřovací metody - možnosti Textové pole: • • • •mikroskopie • •kultivační metody • •imunologické metody (stanovení antigenu nebo protilátek) • •molekulárně-biologické metody 1. a) nativní preparát •kultury •nespecifická barvení (Lugol), •specifická barvení (MycoInk, Rylux – vážou se na chitin) 4. Mikroskopie 56 fig001-of •rýžový agar (kultura) Calcofluor Myco Ink b) fixovaný preparát •obecná barvení (Gram) •speciální barvení (imunofluorescence, Groccot, Gram-Weigert …) punktát z jater - Gram •Výhody: •rychlost (minuty) •relativně nízká cena vyšetření •specificita • riziko kontaminace není velké, ale vyšetření může být pozitivní i v případech, kdy houba již není životaschopná (např. u dermatomykóz) • •Nevýhody: •malá senzitivita, pozitivní obvykle až pozdějších stádiích onemocnění •v materiálu lze většinou jen orientačně zařadit patogena do rodu nebo skupiny (septované x neseptované) 4. Mikroskopie - shrnutí 4. Kultivační metody Kultivační teplota 37+/-1ºC 30+/-1ºC 25+/-1ºC kandida_miska č.1: Sabouraudův agar s glukózou s antibiotiky další speciální média… •chromogenní agary, rýžový agar (dourčení kvasinek) •RPMI 1640, MH s glukózou a metylenovou modří (testování citlivosti) •Czapek Dox (dourčení aspergilů) atd. 4. Kultivační metody ….umožňují zařadit kultivát do rodu a druhu (pomocí makro a mikromorfologie na různých agarech; kvašení či utilizace cukrů, nebo jiných látek; proteomiky, PCR) ….otestovat jeho citlivost k antimykotikům (stále není zcela prokázaný vztah mezi výsledky in vitro a in vivo – vliv pomalého růstu hub, stavba jejich buňky etc.) •standardní metodiky – CLSI, EUCAST (pracné, drahé a rutinně nepoužívané) •v rutinní praxi pomocné metodiky s různou shodou se standardními (ETEST, Sensititre, NeoSensitabs…) •nicméně problematická interpretace (chybí breakpointy) ETEST : stanovení MIC (minimální inhibiční koncentrace) pomocí plastikového proužku s gradientem antimykotika •Výhody: • •zařazení do rodu a druhu, testování citlivosti •specificita (z primárně sterilních materiálů) •relativně levné • • •Nevýhody: • •málo senzitivní (ale víc než mikroskopie) •časově náročnější (dny až týdny) •obtížná interpretace, zejména u primárně nesterilních materiálů • (musíte se rozhodnout mezi kolonizaci, kontaminací nebo infekci) 4. Kultivace – shrnutí …pro dobrou prognózu pacienta s invazivní mykózou je zcela zásadní časné zahájení účinné léčby velký důraz je proto kladen na časnou diagnostiku (tj. imunologické a molekulárně-biologické metody) mortalita IA & čas zahájení léčby Von Eiff, Respiration, 1995 •a) antigeny buněčné stěny hub •invazivní aspergilóza (galaktomanan) •invazivní kandidóza (manan) •invazivní kryptokokóza (glukuronoxylomnnan) •invazivní mykóza (glukan) • • •b) protilátky •endemické mykózy • (histoplazmóza, kokcidioidomykóza..) •alergické stavy •invazivní mykózy? •(pro dg invazivních mykóz není stanovení protilátek obvykle přínosné (obecná promořenost), navíc nejvíce ohrožení neutropeničtí pacienti protilátky ani netvoří) • • • • • 4. Imunologické metody stěna aspergilus fumigatus •latexová aglutinace •ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) •G-test (limulus test) •komplement-fixační reakce, hemaglutinace, imunodifuze v gelu.. 4. Imunologické metody •latexová aglutinace •ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) •G-test (limulus test) •komplement-fixační reakce, hemaglutinace, imunodifuze v gelu.. 4. Imunologické metody •Výhody: •rychlé (časná diagnóza) •senzitivní a specifické •možnost monitorovat léčebnou odpověď (v případě některých antigenů) •vysoká negativní prediktivní hodnota! • (tj. negativní výsledek s vysokou pravděpodobností znamená nepřítomnost choroby) • • •Nevýhody: •falešné pozitivity •nejednoznačná interpretace (u protilátek) •cena 4. Imunologické metody •Výhody: •rychlé (časná diagnóza) •velmi senzitivní • (mohou detekovat jen několik kopií genu v reakci a dokonce méně než • jeden genom) •variabilní • (lze využít jak konzervované, tak variabilní úseky genomu a navrhnout • panfungální nebo specifickou PCR pro určité rody nebo druhy) •kvantifikací lze odlišit kolonizaci od aktivní infekce • •Nevýhody: •kontaminace, standardizace • (při odběru, izolaci DNA, přípravě PCR reakce) •nízká specificita • (zkřížené reakce s jinými příbuznými druhy nebo dokonce lidskou DNA) • • • • • 4. Molekulárně - biologické metody Osnova přednášky 2. Patogeneze nemocí způsobených houbami (mykózy) 1. Morfologie, rozmnožování hub, názvosloví 3. Léčba mykóz - antimykotika 4. Vyšetřovací metody v mykologii 5. Nejčastější mykózy Stanovení diagnózy je komplexní… ürizikové faktory (onkologická onemocnění a jejich léčba, léčba kortikoidy, diabetes, pobyt na JIP, nezralí novorozenci – ale i léčba antibiotiky, vlhká zapářka apod.) üklinické příznaky (pozitivní HRCT plíce, CNS, horečka, vyrážka, soor apod.) ümikrobiologické výsledky (kultivace a mikroskopie, sérologie, PCR) Pro dg. invazivní infekce platí tzv. EORTC/MSG kritéria (infekce prokázaná, pravděpodobná a možná) De Pauw, CID 2008 Epidemiologie - ČR Chrdle 2015 1,67% houbových infekcí/rok (UZIS; publikované práce) 1. kandidové infekce 2. aspergilové infekce Epidemiologie - invazivní mykózy 7 526 IFD; S. Amerika; 2004-2008 Azie 2012 – PATH - Prospektive antifungal therapy) 5. Kandidóza Původci: C. albicans (% v závislosti na populaci) ostatní kandidy – ale i rod Trichosporon, Saccharomyces etc. Infekce: •invazivní – sepse nebo diseminovaná infekce •neinvazivní - onychomykóza, kožní kandidóza, vaginální kandidóza… V malém množství patří kvasinky do běžné flóry kůže či GIT, z čehož plyne, že kandidózy jsou obvykle endogenního původu Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie •běžné bakteriologické metody nekultivační •glukan •PCR 5. Invazivní kandidóza lokalita 1. 2. citace S. Amerika C. albicans (45,6%) C. glabrata (26,0%) 2010, Pfaller Itálie C. albicans (60,3%) C. parapsilosis (16,7%) 2015, Bassetti Brazílie C. albicans (34,3%) C. parapsilosis (24,1%) 2016, Doi Česká republika C. albicans (49,7%) C. glabrata (15,3%) 2018, Kocmanová Čína C. tropicalis (28,6%) C. albicans (23,3%) 2013, Chun-fang …po koaguláza-negativním stafylokoku, zlatém stafylokoku a enterokoku jsou kvasinky třetím až čtvrtým nejčastějším původcem nozokomiální sepse… 5. Aspergilóza Původci: Aspergillus fumigatus (90%) Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus tereus… Infekce: •invazivní - nejčastěji plicní, možnost diseminace hematogenně • neinvazivní – onychomykózy, otomykózy, alergická broncho-pulmolární… Na rozdíl od kvasinek nejsou aspergily součástí běžné flóry člověka a infekce jsou tedy obvykle exogenního původu (stavební práce!!) Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie •ne biochemie - ale mikromorfologie, MALDI nekultivační •galaktomanan, glukan •PCR http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/Aspergillus%20flavus_0.jpg 5. Invazivní aspergilóza nejvyšší incidence u pacientů: Pfaller 2010 nejčastější mezi invazivními infekcemi způsobenými vláknitou houbou, zřídka disseminovaná 5. Zygomykóza Původci: Rhizopus spp. (až 50%) Mucor spp., Absidia spp., Rhizomucor spp., Cunninghamella spp. exogenní (stejně jako aspergilózy), méně časté Infekce: •invazivní - rhinocerebrální, plicní, sinusitidy, možnost diseminace hematogenně • neinvazivní – onychomykózy, otomykózy… Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie •ne biochemie - ale mikromorfologie, MALDI nekultivační •bez serologických metod!! •PCR 5. Fusarióza Původci: Fusarium solani (až 50%), F.oxysporum, F.verticillioides… Infekce: •invazivní - nejčastěji plicní, u imunokompromitovaných až v 70% diseminace!! •neinvazivní – onychomykózy, otomykózy, keratitidy (čočky) exogenní (stejně jako aspergilózy), méně časté Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie •ne biochemie – ale mikromorfologie, MALDI •u diseminovaných pozitivní hemokultura!! nekultivační •glukan •PCR 10_1198105200 petris 5. Kryptokokóza Původce: C. neoformans, C. gatii Infekce: •invazivní - primárně plicní, při diseminaci má afinitu k CNS (meningitidy), často první příznak rozvíjejícího se AIDS (Afrika!) •neinvazivní - kožní exogenní (rezervoár- holubí trus), raritní Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie •v mikroskopickém preparátu typické polysacharidové pouzdro •kultivace – běžné půdy nekultivační •glukuronoxylomanan •PCR cry1_l 5. Pneumocystová pneumonie Původce: P. jiroveci (na počest českého parazitologa prof.Jírovce) – původně parazit, přeřazeno k houbám na základě studia genomu Infekce: •invazivní - plicní, často první příznak rozvíjejícího se AIDS, komplikace u neutropenických pacientů •neinvazivní – nejsou exogenní (ubikvitní), raritní Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie: •jen mikroskopie nekultivační •glukan (krev, tekutina z BAL) •PCR (tekutina z BAL) fig85_2 pcpcysta © E.Keiser 5. Povrchové mykózy (neinvazivní) •dermatofytózy (tinea – dle lokalizace capitis, • corporis, manus, pedis, unguium - onychomykózy) •(Trichophyton spp., Epidermophyton floccosum, • Microsporum spp...) •kandidózy (C. albicans, C. parapsilosis, T. asahii…) •hyfomykózy (Aspergillus spp., Fusarium spp., S.brevicaulis…) •keratomykózy (Malassezia furfur…) Dermatofyt_Parker KOHtineaversicolor Mikrobiologická diagnostika: kultivace a mikroskopie: •mikroskopie (speciální barvení) •kultivace až 6 týdnů nekultivační •neprovádí se Závěry rozdíl bakterie x houby, jak se dělí mikrobiologická diagnostika (mikroskopie, kultivace, sérologie, PCR) nejpočetnější (dermatomykózy, kandidózy, aspergilózy,) v diagnostice je nutný komplexní přístup (rizikové faktory x klinický stav x mikrobiologie) mykózy (invazivní x neinvazivní)