Úloha 1. Spektrofotometrie – Absorpční křivka eosinu a stanovení
jeho koncentrace
Požadované znalosti: Optické laboratorní metody
Cíl úlohy:
Určení absorpčního maxima eosinu z absorpční křivky. Spektrofotometrické stanovení
koncentrace.
Úkol 1
Měření absorpční křivky eosinu a určení maxima v oblasti viditelného spektra.
Potřeby k měření:
Spektrofotometr Specol, automatická pipeta, roztoky pro měření, destilovaná voda.
Pracovní postup:
1) Zapněte spektrofotometr a nastavte pomocí voliče vlnových délek vlnovou délku
450nm.
2) Zkontrolujte čistotu kyvet (pozor: každá kyveta má 2 stěny čiré a 2 matné). Kyvetu
uchopte vždy pouze za matné stěny.
3) Spektrofotometr Specol má pohyblivý držák měřícího nástavce pro 2 kyvety, vložte
nejprve kyvetu s destilovanou vodou do jednoho úchytu, do druhého úchytu kyvetu
s měřeným roztokem. Kyvety musí být naplněny nejméně do dvou třetin.
4) Změřte hodnotu absorbance. Pro destilovanou vodu se na displeji spektrofotometru
musí ukázat hodnota 0,000. To znamená, že pro destilovanou vodu se automaticky nastavila
hodnota absorbance 0,000. Nyní do měřícího prostoru zasuňte kyvetu s měřeným roztokem a
odečtěte jeho absorbanci A.
5) Poté do měřícího prostoru zasuňte opět kyvetu s destilovanou vodou a hodnotu vlnové
délky zvětšete o 5 nm. Po vynulování displeje (absorbance pro destilovanou vodu opět 0,000)
vložte do měřícího prostoru kyvetu se zkoumaným roztokem a odečtěte jeho absorbanci A.
6) Uvedený postup opakujte a vlnovou délku světla zvyšte při každém kroku o 5 nm. Při
proměřování absorpční křivky postupujeme do vlnové délky 550 nm.
7) Do grafu vyneste závislost absorbance na vlnové délce a odečtěte absorpční
maximum, což je vlnová délka, při které je absorbance měřeného roztoku nejvyšší.
Úkol 2
Spektrofotometrické stanovování koncentrace roztoků.
Potřeby k měření:
Spektrofotometr Boeco, automatická pipeta, stojan s potřebným množstvím zkumavek, roztok
pro měření o známé koncentraci, vzorek o neznámé koncentraci, destilovaná voda, buničitá
vata.
Pracovní postup:
1. Zásobní roztok o známé koncentraci nařeďte destilovanou vodou tak, aby jste získali
několik dalších roztoků o známých nižších koncentracích než byla původní koncentrace.
Ředění zásobního roztoku proveďte nejlépe pomocí křížového pravidla. (Např. pro eosin
máme zásobní roztok o koncentraci 5μg/l a pomocí křížového pravidla a přesného ředění
připravíme roztoky o koncentraci 4, 3, 2 a 1μg/l).
2. Zapněte spektrofotometr a nastavte pomocí voliče vlnových délek vlnovou délku dříve
zjištěného absorpčního maxima eosinu
3. Zkontrolujte čistotu kyvet (pozor: každá kyveta má 2 stěny čiré a 2 matné). Kyvetu
uchopte vždy pouze za matné stěny.
4. Kyvety musí být naplněny nejméně do dvou třetin. Spektrofotometr Boeco má pouze
jeden držák, vložte nejdříve kyvetu s destilovanou vodou, potom teprve kyvetu s měřeným
roztokem o nejnižší koncentraci.
5. Změřte hodnotu absorbance. Pro destilovanou vodu se na displeji spektrofotometru
musí ukázat hodnota absorbance 0,000. To znamená, že pro destilovanou vodu se automaticky
nastavila hodnota absorbance 0,000. Nyní do měřícího prostoru zasuňte kyvetu s měřeným
roztokem o nejnižší koncentraci a odečtěte jeho absorbanci A.
6. Poté opět do měřícího prostoru zasuňte opět kyvetu s destilovanou vodou. Po
vynulování displeje (absorbance pro destilovanou vodu 0,000) vložte do měřícího prostoru
kyvetu s naředěným roztokem o další známé koncentraci a odečtěte jeho absorbanci.
7. Uvedený postup opakujte se všemi připravenými známými koncentracemi
zkoumaného roztoku. Před každou novou koncentrací kalibrujte přístroj destilovanou vodou
(absorbance pro destilovanou vodu 0,000). Vlnovou délku světla neměňte. Použité
koncentrace a jim příslušné naměřené absorbance zapište do tabulky a vytvořte graf závislosti.
8. Nakonec změřte absorbanci téhož roztoku o neznámé koncentraci. Z vytvořeného
grafu odečtěte koncentraci neznámého vzorku.