Úloha 5. Hemolýza erytrocytů ultrazvukem.
Cíl úlohy:
Ověřit účinek ultrazvuku na erytrocyty z hlediska délky jeho působení
Potřeby k měření:
Ultrazvukový generátor BTL-07, mikroskop s připojením k počítači, Bürkerova komůrka,
stojánek se zkumavkami, pipety, zkumavka s plochým dnem na ozvučení, suspenze
erytrocytů, fyziologický roztok, buničitá vata, kontaktní medium (parafinový olej).
Pracovní postup:
V kádince je připravena suspenze erytrocytů (2% koňská krev).
1) Tuto suspenzi po dostatečném promíchání přelijte do skleněné zkumavky s plochým
dnem, stačí cca 3 ml, což je asi polovina zkumavky. Dále pracujte jen s touto suspenzí.
2) Nejprve si spočítejte počet krvinek v této ještě neozvučené (kontrolní) suspenzi.
Suspenzi je třeba naředit 10krát, to je 0,l ml suspenze + 0,9 ml fyziologického roztoku. Před
jakoukoli manipulací je třeba suspenzi promíchat!.
3) Naplňte Bürkerovu komůrku a spočítejte krvinky minimálně ve 20 malých čtvercích.
Spočítejte množství neozvučených krvinek v 1 ml suspenze.
4) Zapněte ultrazvukový generátor. Hlavici upevněnou ve stojanu potřete parafinovým
olejem, abyste docílili dobrého kontaktu hlavice se zkumavkou.
5) Před vlastním provedením hemolýzy nastavte čas - stačí 30 sekund. Sepněte start a
postupně zvyšujte intenzitu ultrazvuku. Na hlavici v parafinovém oleji můžete sledovat
kavitační bubliny. Časový spínač se automaticky vypne.
6) Nyní zkumavku s plochým dnem položte na hlavici. Nastavte intenzitu 0,1W/cm2
a
dobu ozvučení 30 sekund. Sepněte START a po dané době ozvučení přístroj automaticky
vypne. Z ozvučené suspenze po promíchání odeberte 0,1ml nařeďte přidáním 0,9ml
fyziologického roztoku a spočítejte erytrocyty.
7) Suspenzi v kádince s plochým dnem znovu ozvučte opět po dobu 30s. Po ozvučení
dále postupujte dle bodu č.6. V případě, že průměrný počet krvinek v jedné komůrce klesne
pod 5 neřeďte již suspenzi a Bürkerovu komůrku plňte neředěnou suspenzí!
8) Celkem provedete 6 ozvučování, pouze pokud by k plné hemolýze došlo dříve
(například po čtvrtém třicetisekundovém ozvučování) pokus ukončíte.
9) Do tabulky zaneste počet krvinek přepočítaný na 1ml plné krve a stupeň hemolýzy
v závislosti na době ozvučení, do grafu vyneste závislost stupně hemolýzy n a době ozvučení.
V diskuzi se zamyslete nad možnými vlivy ultrazvuku na organismus.