Adaptivní (získaná) imunitní reakce Jiří Litzman ADAPTIVNÍ SYSTÉM: - Je založen na obrovském repertoáru klonů Band T-lymfocytů, z nichž každý nese poněkud odlišné receptory (BCR resp. TCR) - “Rozpustné receptory” adaptivního systému jsou protilátky (= rozpustné BCR) - Systém je “anticipační”, klonální, “marnotratný” - Klonální receptory vznikají hlavně přeskupováním genových fragmentů a somatickými mutacemi. Pro stimulaci lymfocytů jsou vždy mutné nejméně 2 signály DENDRITICKÉ BUŇKY MUSÍ BÝT PRE-STIMULOVÁNY SIGNÁLY NEBEZPEČÍ ABY BYLY SCHOPNY AKTIVOVAT T LYMFOCYTY PAMP jsou důležité v aktivaci dendritických buněk Aktivace buněk specifického imunitního systému • B-lymfocyty – vazba nativního antigenu na Bbuněčný receptor (BCR) + pro další vývoj jsou nutné další signály. Rozdílná je aktivace u Tdependentních a T-independentních antigenů. • T-lymfocyty- antigen musí být degradován a navázán na molekuly HLA. Až tento komplex simuluje T-buněčný receptor (TCR) + jsou nutné další kostimulační signály. Antigen-specifické receptory T- a B- lymfocytů L L H H lg-α lg-αlg-β lg-β γ + δ nebo α + β γ δ ε ζ ζ B cell receptor - BCR T-cell receptor - TCR Downloaded from: StudentConsult (on 4 August 2013 10:32 AM) © 2005 Elsevier Kostimulační molekuly při aktivaci T-lymfocytu antigen prezentující buňkou Downloaded from: StudentConsult (on 4 August 2013 10:32 AM) © 2005 Elsevier Kostimlační signály při interakci T-B- lymfocyt Pouze některé signály vedou k stimulaci T-lymfocytů a následné aktivaci a proliferaci Klonálně selekční teorie efektorové buňky antigen paměťové buňky Eliminace autoreaktivních klonů Krev a periferie expanze Smrt buňky Smrt buňky Selekce klonu antigenem Tvorba lymfocytů schopných reagovat potenciálně se všemi antigeny Klonálně selekční teorie F.M. Burnet, 1957 • V průběhu vývoje každého jedince dochází k vývoji buněk se specifickými vazebnými místy pro různé epitopy, přičemž každá buňka reaguje pouze s jedním epitopem. • Během vývoje (zejména intrauterinního) dochází k eliminaci autoreaktivních lymfocytů (zakázané klony, „forbidden clones“), čímž vziká pool buněk schopných reagovat na cizorodé antigeny. • Dojde-li k reakci epitopu s příslušným receptorem, dochází k proliferaci daného buněčného klonu. (tj k selekci klonu) • Po opakovaném dělení dosáhnou buňky stadia terminálně diferencovaných buněk (např. plazmatická buňka), ty se již dále nedělí. • U části stimulovaných a proliferujících buněk k terminální diferenciaci nedojde, přetrvávají v těle jako buňky paměťové. Variabilní oblast imunoglobulinové molekuly Variabilní oblast Ig molekuly váže antigenní epitop VDJ rekombinace při vzniku variabilního místa imunoglobulinové molekuly Germline configuration D to J recombination V to DJ recombination transcription, splicing V segments D segments J segments Constant region exons AAA Adapted from Janeway 2001 Variabilita pro těžký řetězec: 100 × 50 × 9 = 45 000 variant, Lehký řetězec (Igκ a Igλ): 70 × 5 + 30 × 9 = 620 variant; Protože tyto lze mezi sebou libovolně kombinovat, výsledný teoretický možných kvartérních struktur variabilní čísti molekuly imunoglobulinu je 45 000 × 620 = 27 900 000. Segment (počet genů) IgH Igκ Igλ V ~ 100 ~ 70 ~ 30 D ~ 50 — — J 9 5 9 Zdroj: Wikipedie Variabilní část imunoglobulinové molekuly teoretický počet variant Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 11:29 AM) © 2005 Elsevier Selekce B-lymocytů s nejvyšší afinitou k antigenu v germinálních centrech Izotypový přesmyk IMUNOGLOBULIN = PROTILÁTKA • strukturálně příbuzné glykoproteiny produkované B lymfocyty • vázané na membránu B lymfocytu – receptory zprostředkující aktivaci B lymfocytu • sekretované (rozpustné) – mediátory specifické humorální imunity Struktura molekuly protilátky • 2 identické těžké řetězce (H) a 2 identické lehké řetězce (L) spojené disulfidickými můstky • strukturně podobné domény (110-120 AK): 2 u lehkých řetězců, 4-5 domén u těžkých řetězců • lehký i těžký řetězec – variabilní oblast (VH a VL); N-konec • každá oblast obsahuje 3 hypervariabilní úseky (6-10 AK) • vazba antigenu – konstantní oblast (CL, CH1-CH3/CH4); C-konec • CL - izotyp kappa, lambda • CH - izotyp (třída) protilátky (IgG, M, A, E, D), podtřídy - membránově vázaná nebo sekretovaná forma - biologické (efektorové) funkce protilátky • flexibilita vazebné části – pantová oblast mezi CH1 a CH2 Schematické zobrazení sekretované a povrchově vázané molekuly protilátky transmembránová část CH Třídy imunoglobulinů, formy výskytu IgA dimer (monomer, trimer) IgM pentamer (hexamer) IgG, IgE, IgD monomery Oligomery jsou spojeny J řetězcem. Membránové formy vždy jako monomer. Třídy a podtřídy imunoglobulinů Izotyp Podtřídy Koncentrace v séru Biol. poločas Funkce IgM - 0,9-2,5 g/l 6 d Receptor pro antigen (naivní B lymfocyty); primární odpověď; aktivace komplementu IgD - Stopa 3 d Receptor pro antigen (naivní B lymfocyty) IgG IgG1-4 8-18 g/l (převaha IgG1) 21 d Sekundární odpověď; neonatální imunita; aktivace komplementu; opsonizace; neutralizace IgA IgA1,2 0,9-3,5 g/l 6 d Slizniční imunita; opsonizace IgE - 0,0003 g/l 2 d Obrana proti parazitům; reakce časné přecitlivělosti IgM • vázaný na membránu ve formě monomeru – receptor na B lymfocytech – po navázání antigenu zprostředkuje aktivaci B lymfocytů, důležitý pro vývoj B lymfocytů • rozpustný ve formě pentameru (hexameru) – 10 (12) vazebných míst • zajišťuje primární imunitní odpověď • účinná aktivace komplementu IgM sekretovaná forma IgG1-4 • nejhojnější protilátka v séru, intersticiální tekutině • největší zastoupení má podtřída IgG1 • výskyt ve formě monomeru • nejdelší poločas (21 d) • přestup přes placentu • klíčová úloha v sekundární imunitní odpovědi • aktivace komplementu, opsonizace, neutralizace IgA1,2 • slizniční forma (dimer) – významná úloha ve slizniční imunitě (neutralizace, opsonizace; neaktivuje C) – produkován plazmatickými buňkami a B lymfocyty v submukóze – transportován na slizniční povrch pomocí transportního Fc receptoru (poly-Ig-receptor) – transport přes epitel transcytózou: endocytóza – přeprava v transportním váčku – fúze s luminální membránou – odštěpení z receptoru proteolýzou – část poly-Ig-receptoru zůstává po uvolnění na slizniční povrch součástí dimeru IgA = sekreční komponenta – zajišťuje rezistenci vůči proteázám • sérová forma (monomer, dimer, trimer) – opsonizace Transcytóza IgA Vazba antigenu a protilátky • nekovalentní komplexy (iontové, hydrofobní, van der Waalsovy síly, vodíkové můstky) • vazba je reverzibilní • vysoká diversita protilátek: > 1011 různých vazebných míst • komplementarita vazebného místa protilátky s epitopem antigenu – hypervariabilní oblasti VL a VH (CDR1-3 – complementarity determining regions) – jedinečnost vazebného místa dána procesem VDJ (VJ) rekombinace a somatickými hypermutacemi • přístupnost epitopů v závislosti na konformaci antigenu Vysoká afinita Nízká afinita Ab1 Ag2 Ab1 Ag1 Afinita protilátek - vyjadřuje sílu interakce mezi 1 epitopem daného antigenu a vazebným místem protilátky Biologické funkce imunoglobulinových molekul • Aktivace komplementového systému (IgG, IgM) • Opsonizace (zejména IgG, též IgA) • Neutralizace antigenů (IgG, IgA, IgM) • Zábrana adherence (IgA, IgG) • Aglutinace, precipitace (IgG, IgM) • Degranulace žírných buněk (IgE) • Přechod placentou (IgG) • Imunoregulace (zejména IgG) • Fenomén ADCC ( IgG) Biologické funkce imunoglobulinových molekul Polyklonální a monoklonální protilátky • polyklonální (séra) – směs imunoglobulinových molekul s různou specificitou (zpravidla proti různým epitopům 1 antigenu) – příprava imunizací zvířat • monoklonální – produkt 1 klonu B lymfocytů s jedinečnou specificitou – produkce nádorem z plazmatickým buněk (myelom) – příprava hybridomovou technologií Příprava monoklonálních protilátek Využití monoklonálních protilátek • v diagnostice ke klasifikaci lymfocytů a jiných leukocytů (CD markery, průtoková cytometrie) • v diagnostice infekčních či systémových onemocnění nebo nádorů, pokud jsou známy specifické antigeny (protilátky) vyskytující se u těchto onemocnění (bez ohledu na příčinnou souvislost; imunoanalýzy, průtoková cytometrie) • v terapii, k zacílení buněk a molekul důležitých v patogenezi nemocí • ve výzkumu Typy monoklonálních protilátek používaných k terapii Hohlfeld R et al. (2005) Drug Insight: using monoclonal antibodies to treat multiple sclerosis; Nat Clin Pract Neurol 1 34-44 [doi: 10.1038/ncpneuro0016] Příklady klinického využití monoklonálních protilátek v léčbě imunopatologických chorob • Imunosuprese: anti-CD3 (OKT3), – anti CD25 (basiliximab, daclizumab), – anti CD20 (rituximab) • Blokáda prozánětlivých cytokinů: – anti –TNF-a (infliximab, adalimumab) – revmatoidní artitida, Crohnova choroba, • Blokáda adhezivních molekul: – anti integrin a4b1 (natalizumab) – roztroušená mozkomíšní skleróza – Anti-CD11a (efalizumab) - psoriáza • Protialergická léčba: – anti-IgE (omalizumab): těžké formy astmatu Příklady využití monoklonálních protilátek v léčbě zhoubných nádorů • Protilátky proti anigenům bílých krvinek: – anti CD-20 (rituximab) léčba lymfomů, – anti-CD52 (Alemtuzumab) – léčba lymfomů • Anti-receptorové protilátky: – anti-epidermal growth factor (receptor HER-2) (trastuzumab) – mamární karcinom – anti-epidermal growth factor (receptor EGFR) (cetuximab) – kolorektální karcinom Další příklady využití monoklonálních protilátek v medicíně • Antiagregační léčba: – trombocytární receptor gpIIb/IIIa (abciximab) • Antivirová léčba: – RS virus (palivizumab) Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 11:29 AM) © 2005 Elsevier Izotypový přesmyk závisí na cytokinovém prostředí a stimulaci Th lymfocyty Přenos aktivačního signálu v B-lymfocytech http://www.cellsignal.com/reference/pathway/B_Cell_Antigen.html Primární fáze protilátkové reakce • Nativní nebo opsonizovaný antigen zachycen folikulárními dendritickými buňkami. • Stimulace B-lymfocytů v lymfoidních foliklech. • Současně prezentace antigenů T-lymfocytům v T-zóně – ty postupně migrují na okraj lymfoidních foliklů. • Vzniklé plazmatické buňky produkují IgM (především v kostní dřeni). Sekundární fáze protilátkové reakce • Probíhá v germinálních centrech sekundárních lymfoidních foliklů. • Tfh lymfocyty stimulují B-lymfocyty k somatickým hypermutacím a isotypovému přesmyku. • Dochází k afinitní maturaci B-lymfocytů. • Značná část B-lymfocytů s nízkou afinitou BCR hyne. Dva typy B-lymfocytární odpovědi na antigen • T-independentní odpověď – Odpověď na antigeny s řadou stejných epitopů – typicky polysacharidové antigeny. – Nahromadění B-buněčných receptorů (BCR) do jednoho místa vede k vzájemné aktivaci tyrozinkináz a následné aktivaci buňky. – Tento proces nevyžaduje pomoc T-lymfocytů. – Vytváří se pouze protilátky třídy IgM (nedochází k izotypovému přesmyku), nedojde k afinitní maturaci, nevytváří se imunitní paměť. – Tj. proběhne pouze primární fáze protilátkové odpovědi. • T dependentní odpověď – Vyžaduje souhru B-lymfocytů, antigen prezentujících buněk (mohou jimi být i Blymfocyty) a T-lymfocytů. – Dochází k isotypovému přesmyku, afinitní maturaci, vzniku paměťových buněk. – Tj. proběhne primární i sekundární fáze protilátkové odpovědi. Imunitní odpověď po prvním a opakovaném setkání se s antigenem (“primární a sekundární protilátková odpověď“) Secondary antibody response Primary antibody response IgM IgG Firstexporsure Serumantibodytiters Weeks Secondexposureto antigen Downloaded from: StudentConsult (on 15 July 2006 09:09 AM) © 2005 Elsevier Imunitní odpověď po prvním a opakovaném setkání se s antigenem (“primární a sekundární imunitní odpověď“) Imunologická paměť • Je jedním z charakteristických rysů adaptivní imunity. • Je založena na existenci dlouho žijících, antigen-specifických paměťových T- a B-lymfocytů. • Tyto buňky jsou v případě opakované antigenní stimulace schopny rychlé proliferace a terminální diferenciace v efektorové buněčné formy. • Výsledkem je rychlejší, rozsáhlejší a efektivnější odpověď po opakovaném setkání se s antigenem. Biologické funkce imunoglobulinových molekul • Aktivace komplementového systému (IgG, IgM) • Opsonizace (zejména IgG) • Neuralizace antigenů (IgG, IgA, IgM) • Zábrana adherence (IgA, IgG) • Aglutinace, precipitace (IgG, IgM) • Degranulace žírných buněk (IgE) • Imunoregulace (zejména IgG) Mechanismy specifické buněčné imunity Jiří Litzman Downloaded from: StudentConsult (on 15 July 2006 09:09 AM) © 2005 Elsevier Dvě větve adaptivní imunity Aktivace T-lymfocytů • T-lymfocyty mohou být stimulován pouze komplexy antigen-HLA. • HLA antigeny musí být stejné, jaké má příslušný konkrétní jedinec = fenomén HLA restrikce. Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier Interakce mezi TCR a komplexem HLA-polypeptid Downloaded from: StudentConsult (on 20 July 2006 09:34 AM) © 2005 Elsevier Povrchové struktury T-lymfocytů a jejich ligandy Thymová výchova T-lymfocytů • Pozitivní selekce buněk reagujících s nízkou afinitou s HLA antigeny na povrchu antigenprezentujících buněk. Probíhá v kortikální oblasti. Zajišťuje přežití jen těch thymocytů, které později rozpoznají komplex antigen-HLA. • Negativní selekce – apoptózou hynou thymocyty reagující s vysokou afinitou s komplexy HLAautoantigeny. Probíhá zejména v subkortikální oblasti thymu. Zajišťuje odstranění autorektivních klonů. • V průběhu obou procesů hyne více než 85% thymocytů. Vývoj lymfocytů v thymu Význam síly interakce TCR a APC v thymu na další osud lymfocytu Nestimulované buňky Pozitivní selekce Negativní selekce Síla interakce buňky zahynou Možný osud T-lymfocytů v thymu T lymfocyty – centrální role v řízení imunitní odpovědi Antigen prezentujívcí buňka Antigen Th lymfocyt B-lymfocyt Tc lymfocyt Granulocyt Macrofág NK NK cell Downloaded from: StudentConsult (on 20 July 2006 09:34 AM) © 2005 Elsevier Klonálně-selekční teorie platí i pro T-lymfocyty Základní subpopulace T-lymfocytů • Cytotoxické T-lymfocyty (CD8+): zabíjejí cílové buňky. Rozeznávají komplex HLA-I-antigenní polypeptid. • Pomocné T-lymfocyty (CD4+): produkcí pomocných signálů umožňují aktivaci a diferenciaci B- lymfocytů a aktivaci makrofágů. Rozeznávají komplex HLA-II-antigenní polypeptid. • Regulační T-lymfocyty (CD4+): účastní se udržování imunitní tolerance Subpopulace Th lymfocytů • Th1 lymfocyty – Produkce IFN-g, IL-2, IL-3, – Stimulují funkci makrofágů, působí prozánětlivě – Účast v patogenezi např. roztroušené mozkomíšní sklerózy • Th2 lymfocyty – Produkce IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 – Stimulují produkci protilátek, včetně IgE – Účast v patogenezi např. atopických chorob • Th17 lymfocyty – Produkce IL-17 – Důležité v obraně proti infekcím. – Hrají důležitou roli při chronických zánětlivých procesech. Další subpopulace • Th9 lymfocyty – Produkují hlavně IL-9 – Hraji roli při alergických a autoimunitních chorobách, v protinádorové imunitě • Th22 lymfocyty – Produkce IL-22 a TNF-alfa, ale ne IFN-gamma, IL-4, nebo IL-17. – Účast hlavně v kožních zánětlivých procesech (psoriáza) s dalších subepitelálních tkáních (alergické fenomény). ˇVýznam při hojení ran. • Th25 lymfocyty • Tfh lymfocyty – Nacházejí se především v lymfoidních foliklech – Vysoká exprese CXCR5, CD40L – Pomoc B-lymfocytům – Tvorba IL-21, IL-4 Vývoj TH1 a TH2 lymfocytů Bakterie TH 1 TH 0 TH 2 Makrofágy NK buňky Žírné buňky O tom, kam se bude vyvíjet Th0 lymfocyt rozhoduje cytokinové prostředí Funkce Th1 and Th2 lymfocytů Žírné buňky Makrofágy Inhibitce Th1 lymfocyt Th2 lymfocyt B lymfocyt Eosinofilní granulocyt Th1 lymfocyty • Produkují zejména IFN-g, IL-2, IL-3. • Diferencují se pod vlivem IL-12, IL-18, IFN-g • Působí prozánětlivě, stimulují funkci makrofágů. • Snad se spolupodílejí se na patogenezi autoimunitní thyreoiditidy, roztroušené mozkomíšní sklerózy. • Produkcí IFN-g, tlumí funkci Th2 lymfocytů. • Hrají důležitou roli v akutní rejekci štěpu. Funkce Th1 buněk Th2 lymfocyty • Produkují zejména IL-3, IL-4, IL-5, IL-10. • Diferencují se pod vlivem IL-4 • Stimulují tvorbu protilátek. • Spolupodílejí se na patogenezi atopických chorob. • Jejich predominance se objevuje během těhotenství. • Produkcí IL-10 a IL-4 tlumí funkci Th1 lymfocytů. Pro tvorbu protilátek B-lymfocyty je nutná pomoc Th2 buněk Th17 lymfoycyty • Vznikají z antigenem-stimulovaných T-lymfocytů v prostředí TGF-b a IL-6. • Produkuji IL-17A , IL-17F a IL-23. • Mají význam v obraně proti extracelulárním patogenům. • Patogeneticky se uplatňují při chronických zánětlivých procesech a vzniku některých autoimunitních chorob ( ?Crohnova choroba, ?Revmatoidní artitida). Cytotoxické T-lymfocyty • Jsou CD8+ • Rozeznávají cizorodý antigen prezentovaný na HLA-I antigenech. • Cytotoxicky působí perforin, dále různé mechanismy indikující apoptózu cílové buňky (granzymy, FasL, lymfotoxin). • Jsou i důležitými producenty cytokinů (Tc1 a Tc2 buňky) Cytotoxická funkce CD8+ T lymfocytů Cytotoxický efekt CD8+ lymfocytů Cytotoxická granula Základní typy regulačních T-lymfocytů Treg lymfocyty • Samostatná subpopulace přirozeně regulačních buněk. • Vývoj v thymu, za určitých okolností je možný vývoj i v periferii (indukované T-reg lymfocyty – i Treg). • Transkripčním faktorem je FOX-P3 (možné terapeutické využití, využití při diagnostice) • Jsou CD4+CD25+. • Přímo působí na jiné T-lymfocyty prostřednictvím molekuly CTLA-4 a snad i membránovou formou TGF-b. • Tvoří asi 5-10% CD4+ lymfocytů. • Zajišťují autoleranci, brání rozvoji autoimunitních chorob. • Zajištují ale také „autotoleranci“ nádorových buněk. TR-1 lymfocyty • Jedná se o indukované regulační CD4+ buňky. • Vznikají z aktivovaných T-lymfocytů působením IL-10. • Produkují vysoké hladiny IL-10, IFN-g, TGF-b, ne však IL-2. • Není jasný vztah k obdobným tzv. Th3 buňkám, i-Treg. T-buněčný receptor gd-T-lymfocyty • Tvoří asi 5% lymfocytů periferní krve, výrazně častěji se objevují např. mezi epiteliemi. • Jsou CD3+, CD4-CD8-. • Mají nízkou antigenní specificitu. • Thymus není nutný pro jejich vývoj. • Mohou reagovat s nativními antigeny nebo antigeny předloženými jinými molekulami než HLA (např. HSP). • Zvýšené počty jsou nacházeny u mykobakteriálních onemocnění, Erlichiózy, listeriózy, některých nádorů a autoimunitních chorob. Aktivace T-lymfocytů Dva typy antigenů podle typů stimulace B-lymfocytů • T- dependentní: Iniciace odpovědi vyžaduje spolupráci Th lymfocytů, B-lymfocytů a antigen prezentujících buněk (APC).Jedná se o nejčastější typ imunitní odpovědi. • T-independentní: Pro stimulaci B-lymfocytů nejsou T-lymfocyty (a APC) nutné. Příkladem jsou některé polysacharidy. Dochází k tvorbě pouze IgM (nedochází k izotypovému přesmyku). Nevzniká žádná imunitní paměť. Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier Vazba peptidů na HLA molekuly HLA-I antigeny • Exprimovány na všech jaderných buňkách. • Prezentují antigeny CD8+ lymfocytům. • Prezentované antigeny jsou produkty buněčné proteosyntézy. • Polypeptidové řetězce mají asi 10 aminokyselin. HLA-II antigeny • Exprimovány na profesionálních antigenprezentujících buňkách (monocyty a makrofágy, aktivované dendritické buňky, B-lymfocyty) • Antigeny jsou předkládány CD4+ buňkám • Antigeny jsou exogenního původu • Polypeptidové řetězce mají asi 20 aminokyselin Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier Vazba antigenu na HLA-I a HLA-II antigeny Downloaded from: StudentConsult (on 18 July 2006 08:13 AM) © 2005 Elsevier Interakce TCR-polypeptid-HLA molekula Kostimulační molekuly účastnící se interakce mezi T-lymfocytem a antigen-prezentující buňkou APC T-lymfocyt Profesionální antigen-prezentující buňky • Aktivované dendritické buňky • Monocyty a makrofágy • B-lymfocyty Stimulace T-lymfocytu antigenem je komplexní reakcí vyžadující vždy 2 signály PAM P Klidový T-lymfocyt Patogen antigen Toll-like receptor Antigen-presenting cell MHC Il peptid T-cell receptor B 7 CD 28 Aktivace Aktivace imunitního systému antigenem B-cell receptor Antigen Tvorba protilátek Interleukin 4,5,10 Aktivace B-buněk Interleukin 4 Antigen prezentující buňka B cell peptid DC80/86 MHCII CD28 Th0 T Cell Th2 T Cell Interleukin 4 Aktivace TCR antigenem a superantigenem MHC class II Aktivační signál Superantigen T cell APC TRC Aktivační signál αβ α β αβ α β Antigen Superantigeny • Váží se na invariantní oblasti HLA-II antigenů a TCR. • Následkem vazby je polyklonální stimulace Tlymfocytů bez přítomnosti specifického antigenu. • Stimulace může vést k indukci autoimunity. • Velké množství uvolněných cytokinů může způsobit těžké postižení organismu. • Příklady: stafylokový enterotoxin, erytrogenní toxin streptokoků.