Plasma proteins The importance of plasma protein • •Transport osubstances insoluble in water, drugs Albumin - Ca, Mg, Zn, thyroxin, bilirubin, drugs Prealbumin - thyroxine Ceruloplasmin - Cu Transferrin-Fe Apoprotein - lipids •Defense against infection oImmunoglobulins, complement In the blood there are hundreds of different proteins. They differ in concentration, molecular size, and of course functions. Most plasma proteins are formed in the liver. Plasma protein performs the following functions. Participates in the transport of a number of minerals, hormones, lipids and catabolites, especially if they are insoluble in water, the protein can bind drugs. Immunoglobulines defense against infection The importance of plasma protein • •Oncotic pressure oalbumin • •Coagulation and fibrinolysis ocoagulation factors and factors ensuring of dissolution of thrombus •Enzymes ocholinesterase and ceruloplasmin • •Protease inhibitors oprevent damage by proteolytic enzymes :a1-antitrypsin, a1-antichymotrypsin and a2-macroglobulin • •Special functions such as protection against free radicals- inhibition of their formation (albumin, ceruloplasmin, haptoglobin, hemopexin) The main protein which contributes to maintain oncotic pressure, which keeps the fluid in the bloodstream is albumin Blood coagulation and fibrinolysis is provided by coagulation factors and factors which leads to the dissolution of thrombus. Proteins also act as enzymes - these include cholinesterase that catalyze the hydrolysis of these cholinergic neurotransmitters, such as breaking acetylcholine into choline and acetic acid. These reactions are necessary to allow a cholinergic neuron to return to its resting state after activation or ceruloplasmin,which has oxidation properties important for ferrum metabolism. important function is an inhibition of proteases, which prevent damage by proteolytic enzymes and prevent infestation of tissue - this includes alpha-1 antitrypsin alpha2 macroglobulin The special features include protection against free radicals, which is secured by such ceruloplasmin albumin, haptoglobin. Total protein: ref. range 63-84g/l •Decreased synthesis oHepatopathie oMalnutrition •Increased loss oUrine –nefrotic syndrom oFaeces – exsudative enteropathy •Increased blood volume (oedema,ascites) • The concentration of total protein in blood is 62-82 g / l Changes in the concentration of total protein are in relation to the changes in the concentration of albumin and immunoglobulins because they constitute the hights proportion. So we can see hypoproteinemia in hypoalbuminea or hyperproteinemia in for. Example chronic inflammation or in monoclonal gaamopathy. Other reason it coud be slight hypoproteinemia in hyperhydratation or hyperproteinemia in dehydratation. Total proteins -hyperproteinemia •Dehydratation •Chronic inflammation, cirrhosis, monoclonal gammopathies Protein electrophoresis Prealbumin •hepatic transport protein for thyroid hormones •transport protein for vitamin A (to prevent loss of urine) •¯ = failure of protein synthesis in the liver in severe liver disease or protein malnutrition o o oRef.ranges: 0,2-0,40 g/l oHalf-time: 2 days Albumin ( 35-53g/l) §Formed in the liver, molecular weight 68,000 § §Oncotic pressure §Transport protein for unconjugated bilirubin, thyroid hormones, calcium, magnesium, zinc and other minerals,pharmaceuticals §Component of the extracellular antioxidant system q •decreased synthesis •hepatopathy or protein malnutrition •increased catabolism in acute inflammation and tumors •increased losses by kidneys (nephrotic syndrome), GIT, skin •half-life 20 days Molekula Ig Malabsorption, protein loosing enteropathie Acute phase proteins • •Formation in the liver parenchyma (de novo) - after washout of cytokines IL-6, TNF •Regulators of inflammation – fever, leukocytosis, cortisol…. •Mediators of biological responses o CRP and complement • •Binding inhibitors of proteolytic enzymes Α1 antitrypsin Acute phase proteins •With a fast response Increase after 2-4 hours (IL6, Procalcitonin) • increase after 6 hours, maximum of 48 hours, • the rise to 1000times (CRP) • •Slower onset and peak • The rise for 12 to 24 hours, peak 3-5 days (α1antitrypsin, haptoglobin) •Concentration is reduced Prealbumin, albumin, transferrin Influence of acute-phase proteins •Genetically (ceruloplasmin, α1antitrypsin) •Pregnancy, p.o. contraceptives (ceruloplasmin) • •Intravascular hemolysis (haptoglobin) •Inflammatory diseases of liver – decrease of synthesis of proteins CRP • •Opsonization of structures of bacterias and demaged cells •Activation of complement •Imunomodulation effect • •REF.RANGE: < 5mg/l • •Increase - acute inflammation, acute conditions (rheumatic disease, malignancy, stress, post-operative conditions, etc.) o •6- 8 hours after the onset of inflammation Top 1-2 days o CRP • • •Indication: Early diagnosis of bacterial infections Monitoring antibiotics treatment Differentiation of bacterial and viral etiology • oNeonatal sepsis (with IL6) o •Late reactions to SIRS •It does not help for differentiation between SIRS and sepsis • • • • C:\Users\3050\Desktop\40560_2017_246_Fig1_HTML.jpg Prokalcitonin Prokalcitonin Ref.range less than 0,5 ug/l Chronic inflammation 0,5-1ug/l Localized bacterial infection 0,5-2ug/l SIRS 5-10ug/l SEPSIS 10 ug/l or grater Alfa 1 antitrypsin • •protease inhibitor,hepatic glycoprotein inhibitor of proteolytic enzymes (elastase, collagenase) oreleased during the inflammatory response o acute inflammation and acute severe conditions, pregnancy o¯ severe hepatopathy, hereditary defect creation (liver cirrhosis, pulmonary emphysema) Genotyp MZ Alfa 1 antitrypsin deficiency Healthy – genotyp MM Alfa1 antitrypsin deficiency Genotyp MZ decrease to 40-60% activity Genotyp ZZ – decrease to 15% of normal concentration Ref.range 0,9-2,0 g/l Transferrin • •can bind two atoms of iron (Fe 3 +), the transport protein for iron •Increase -lack of iron in the body (with no increase in malnutrition) • •Decrease- excess body iron (hemosiderosis, hemochromatosis,impaired protein synthesis Carbohydrat-deficient transferrin - transferrin with a reduced proportion of sugar components Ref.range 2,0-3,6 g/l Haptoglobin •Haptoglobin binds very tightly hemoglobin molecule, the resulting complex is rapidly cleared from the circulation •Reducing the oxidative potential of free hemoglobin •Anti-inflammatory effects (inhibition of chemotaxis, phagocytosis ...) Increase: acute inflammation Decrease:intravascular haemolysis Ref. range 0,3-2,0 g/l Ceruloplasmin •6-8 atoms of copper (Cu) •Transport of copper •Ferroxidase activity - Fe2+ Fe3+ •Antioxidative effect • •Increase: inflammation, gravidity •Decrease: Wilson disease • Imunoglobulines • Secretion product of differentiated plasma cells Composition 2 heavy (H) and 2 light chains (L) Types of light chains kappa, lambda • Class (isotype) IgG, A, M, D, E Part constant, part variable • Polyclonal immunoglobulins different idiotypes • Monoclonal immunoglobulin product of one plasma cell clone the same isotype and idiotype a molecule of the same physical and chemical properties 34 4c6e40ea8b9d0 Všechny imunoglobulinové molekuly se skládají ze dvou identických těžkých řetězců gama, alfa,mí, delta, epsilon a dvou identických lehkých řetězců kappa nebo lambda. Každý z řetězců má konstantní část a část variabilní, která se účastní rozpoznání a vazbě antigenu. Imunoglobuliny jsou sysntetizovány a secernovány plazmatickými buňkami.Za fyziologického stavu jsou v séru přítomny polyklonální imunoglobuliny , je přítomno až 10 na 11 různých typů variabilních oblastí protilátek. Monoklonální imunoglobulin je produkt jednoho klonu plazmatických buněk.Pokud dojde k maligní přeměně plazmocytu, většinou je zachována schopnost secernovat protilátky, kteréjsou pak monoklonální. Maligní chování tohoto klonu se projeví tím, že infiltruje kostní dřeň vyhubí fyziologické plazmocyty, v krvi jsou polyklonální protilátky nahrazeny obvykle nefuknkčími monoklonálními imunoglobuliny. Monoclonal gammopathies •Malignant monoclonal gammopathies o oMultiple myeloma oMorbus Waldenström oAmyloidosis o • •Monoclonal gammopathies of undetermined significance (MGUS) obrázek-06 Monoklonální gamapatie představují velkou skupinu lymforpoliferativích onemocnění B-lymfoidní řady v kostní dřeni jsou maligní nebo potenciálně maligní. Ve většině případů jsou provázeny syntézou a sekrecí monoklonální imunoglobulinu nebo jeho strukturní částí. Dělí se na dvě velké skupiny.Monoklonální gamapatie nejasného významu se považuje nález přítomnosti monoklonálního imunoglobulinu bez přítomnosti známek maligního onemocnění.V současné době se považuje za první fáyi mnohočetného myelomu. Medián doby do rozvoje MM je asi 10 let. ELFO serum and urine Úlohou laboratoře je identifikovat monoklonální protein při diagnostice MG. Mohoklonálním proteinem rozumíme kompletní molekulu imunoglobulinu nebo její fragmenty. Pro vyhledávání kompletní molekuly slouží desítky let klasická elektroforéza bílkovinv séru. My provádíme elektroforézu bílkovin na agaróze, používáme diagnostický set Hydrogel 30 od firmy SEBIA, beta zóna se dělí na beta1 a beta2 zónu.Mez detekce dle našich zkušeností je 500-2000mg podle pohyblivosti monoklonální komponenty.Moč zahušťujeme centrifugací 40x v zahušťovacích zkumavkách Vivaspin.Mez detekce dle našcich zkušeností je 10-40 mg) Elektroforesis with immunofixation Proteiny separované elektroforézou na alkalicky pufrovaných agarózových gelech jsou inkubovány se specifickými antiséry proti těžkým řetězcům Ig G, Ig A, Ig M a lehkým volným i vázaným kappa a lambda řetězcům. Po odstranění nezreagovaných bílkovin jsou precipitáty obarveny kyselou violetí. Elektroforeogramy se hodnotí vizuálně a pátrá se po přítomnosti monoklonálních bílkovin. Pro typizaci monoklonálního imunoglobulinu a screening v nízkých koncentracích slouží ELFO s následnou imunofixací. Používáme soupravu též firmy Sebia. Mez detekce je 150-500 mg Free light chains •Set FreeLite firmy BindingSite •Analyzer IMMAGE 800 (Beckman Coulter) imunoturbidimetrie (NIPIA) •antibodies are directed against internal epitopes light chains, which are hidden in the complete molecule • • •Kappa free 3,3-19,4mg/l •Lambda free 5,7-26,3 mg/l •ratio κ/λ 0,26-1,65 • • • • • • • Kopie - obrázek-08 Lehké řetězce jsou součástí molekuly imunoglobulinů, fyziologicky jsou vša produkovány v mírném nadbytku nad řetězci těžkými a jsou proto nacházeny i v krevním séru. Při nádorových proliferacích vycházejících z plazmatických buněk můžeme najít v krevním séru výrazně (až o několik řádů) zvýšené koncentrace volných lehkých řetězců jednotho typu, kromě absolutních koncentrací sledujeme také poměr (free kappa/free lambda)Jejich stanovení vyžaduje použití protilátky specifické proti tzv. skrytým determinantám, keré jsou skryty v komůetní molekule imuoglobulinu. Stanovení volných lehkých řetězců provádíme pomocí diagnostické soupravy firmy Binding Site na přístroji Immage, detekční limity se posunujeme na jednotky mg/l. CB=89,6 g/l Incubation BME, 37 ºC Incubation BME,37 ºC Cryoprecipitation Kryoproteinémie je schopnost některých plazmatických proteinů při ochlazení séra (plazmy) reverzibilně precipitovat nebo gelifikovat. Kryoprecipitace je popisována u infekčních (bakteriálních, virových, parazitárních, mykotických), autoimunitních (SLE, reumatická artritida aj.) a u různých lymfoproliferativních onemocnění (MM, Waldenströmova makroglobulinémie, chronická lymfatická leukémie aj.) Kryoproteinémie lze rozdělit na 3 typy: Typ I: způsobené kryoprecipitací monoklonálních imunoglobulinů Typ II: smíšené –způsobené kryoprecipitací komplexů monoklonálních imunoglobulinů s polyklonálními imunoglobuliny Typ III: způsobené kryoprecipitací polyklonálních imunoglobulinů Kryoproteinémie může být příčinou falešných výsledků celé řady vyšetření( KO, elektroforéza aj.) Anamnesis •Male 60 y.o. •7 months back pain, pain in ribs, even during inhalation – diagnosed as Tietze syndrome, classification of pain VAS 6-7, increased back pain, common analgesics with no effect, Doreta (paracetamol+tramadol) with partial effect, additionally strong fatigue • •Is treated for hypertension • •FA: Prestarium o Laboratory results •Increased retention of nitrogen in serum •Hypercalcemia • •Discrepant finding of protein in urine oquantitatively significant proteinuria oSemi-qualitatively with dry chemistry strips +1 (detects albumin only) •Progression of anemia • • • Next steps? Laboratory results Electrophoresis Immunofixation – serum Immunofixation urine serum urine S-ifix: positive FLC ĸ in serum U-ifix: FLC ĸ 2.9g/24 hours FLC ĸ kvant. in serum> 18000 mg/l (3.3-19.4 g/l) FLC ʎ kvant. in serum 1.0 mg/l (5.7-26.3 mg/l) IgD IgE ĸ celk. ĸfree More examinations • •RTG of skeleton oMultiple lytic deposits in skull skeleton, both claviculae, humeri, scapulae, bilateral ribs, in smaller scale both femura •Trepanobiopsy oMassive infiltration of plasmatic cells with pathologic morphology, reduction of granulopoesis Final diagnosis – therapy, monitoring •Multiple myeloma III A (DS) •Symptomatic – anemia, hypercalcemia, impending renal damage • • Therapy: •6 cycles CHT (effect – reached VGPR- very good partial response – more than 90% decrease in FLC urine excretion in 24 hours) •1. Autologous transplantation – CR (complete remission) – no monoclonal protein in serum or urine and normalization of FLC in serum •