Molekulární základ diagnostiky primárních imunodeficitů TOMÁŠ FREIBERGER GENETICKÁ LABORATOŘ, CENTRUM KARDIOVASKULÁRNÍ A TRANSPLANTAČNÍ CHIRURGIE BRNO, ČR Kazuistika 1 - chlapec, IVF, porod v termínu, zkalená plodová voda - 1.den, cárovité slupování kůže - vyloučena epidermolysis bullosa, susp. generalizovaná stafylodermie - leukocytóza, eozinofilie - pokračující deskvamace kůže, otoky; podán oxacilin Jan Helešic, Lenka Krbková, Hana Bučková, Barbora Ravčuková, Hana Grombiříková, Renata Formánková, Petr Sedláček, Jiří Litzman, Tomáš Freiberger T. FREIBERGER, PGS 2021 - Překlad kožní Brno > inf. klinika > konzultace s UKIA Kazuistika 1 - pokračování - 3. den FC k vyloučení hematologické malignity > snížené B lymfocyty, snížené Th lymfocyty, vysoké hladiny IgE, hypereosinofilie > podrobné imunologické vyšetření - TREC 0, KREC 0 - susp. Omenn syndrom > genetické vyšetření T. FREIBERGER, PGS 2021 Kazuistika 1 Sangerovo sekvenování Gen RAG1 - detekovány 2 kauzální mutace (již popsané v souvislosti s Omenn syndromem): ◦c.983G>A; p.Cys328Tyr ◦c.1186C>T; p.Arg396Cys - matka zdravá - nositelka mutace: c.1186C>T; p.Arg396Cys - otec zdravý - nositel mutace: c.983G>A; p.Cys328Tyr - později k dispozici i výsledek vyšetření proliferace T lymfocytů – výrazně snížená T. FREIBERGER, PGS 2021 N. Moehn: Omenn syndrome and RAG1. https://slideplayer.com/slide/9423191/ T. FREIBERGER, PGS 2021 Kazuistika 1 - závěr - dg. Omenn syndrom - 3. den věku dítěte - profylaxe oportunních infekcí - 9. den překlad na transplantační jednotku, - ve 2 měsících HSCT - po HSCT chlapec prospívá T. FREIBERGER, PGS 2021 Omennův syndrom (AR-SCID) OMIM: - autozomálně recesivní onemocnění - neprospívání, průjmy - pneumonie - hepatosplenomegalie - generalizovaná erytrodermie - anemie, trombocytopenie, eozinofilie - lymfadenopatie - virové, mykotické a bakteriální infekce - nízké IgG, A, M; vysoké IgE - nízké B lymfocyty, variabilní počet T lymfocytů (efektorové) - defektní proliferace lymfocytů T. FREIBERGER, PGS 2021 Kazuistika 2 Veronika Kanderova, Hana Grombirikova, Irena Zentsova, Kamila Reblova, Adam Klocperk, Martina Fejtkova, Barbora Ravcukova, Tomas Kalina, Tomas Freiberger#, Anna Sediva# - 15-letý chlapec - v 5 měsících věku neprospívání, lymfadenopatie, opakované enterorhagie, prolaps rekta, hepatosplenomegalie, anémie - ve 4 letech apendektomie pro trvající bolesti břicha, lymfadenopatie mezenterických uzlin - opakované sinusitidy, bronchitidy, otitidy a horečky nejasného původu Haematologica 2019; 104(1): e32-34. T. FREIBERGER, PGS 2021 Kazuistika 2 - pokračování - v 5 letech pneumonie, > chronické atelektázy levého plicního laloku - generalizovaná lymfadenopatie - četné EBV infekce - chronická buněčná aktivace v kostní dřeni bez známek malignity - mírná dysgamaglobulinemie, uspokojivá odpověď na proteinové vakcíny, slabá odpověď na očkování polysacharidovými vakcínami - zvýšený počet aktivovaných T lymfocytů, posun ke zralým efektorovým buňkám, nízká hladina naivních T lymfocytů - nižší počet zralých a zvýšený počet naivních B lymfocytů T. FREIBERGER, PGS 2021 Haematologica 2019; 104(1): e32-34. Kazuistika 2 - pokračování - susp. primární porucha imunity > genetické vyšetření - Sangerovo sekvenování: Geny SH2D1A, BIRC4 (XLP1, 2), PK3CD, PK3R1 (APDS) – kauzální mutace nedetekována ◦> celoexomové sekvenování (WES) T. FREIBERGER, PGS 2021 Haematologica 2019; 104(1): e32-34. WES: Počet unikátních variant 48 632 Hloubka čtení ≥ 8 37 574 Populační frekvence varianty < 0.01 (1000G) 3 841 Varianty v exonu či v kanonickém místě sestřihu 954 Homozygoti 168 Záznam v databázi mutací (HGMD) 24 Se vztahem k fenotypu 1 (CASP8 +/+) Kazuistika 2 - pokračování T. FREIBERGER, PGS 2021 Haematologica 2019; 104(1): e32-34. Úloha Casp-8 v apoptóze a zánětlivé signalizaci T. FREIBERGER, PGS 2021 Kazuistika 2 - pokračování - Gen CASP8: detekována mutace c.1232C>T, p.4111L (dosud nepopsaná) - In silico predikce svědčí pro kauzalitu mutace T. FREIBERGER, PGS 2021 Haematologica 2019; 104(1): e32-34. - Mutace segreguje s fenotypem T. FREIBERGER, PGS 2021 Haematologica 2019; 104(1): e32-34. Kazuistika 2 - pokračování Struktura molekuly CASP8 a poloha mutace T. FREIBERGER, PGS 2021 Haematologica 2019; 104(1): e32-34. Kazuistika 2 - závěr - funkční analýzy - potvrdily funkční význam detekované varianty - chlapec ve stabilizovaném stavu, léčen symptomaticky T. FREIBERGER, PGS 2021 Haematologica 2019; 104(1): e32-34. Deficit CASP8 Autoimunitní lymfoproliferativní syndrom (ALPS) IIB (OMIM) OMIM: - autozomálně recesivní onemocnění - malý vzrůst, neprospívání - postižení respiračního traktu, pneumonie - splenomegalie - chronické průjmy - ekzém - lymfadenopatie - opakované sinobronchiální infekce - chybějící odpověď na pneumokokovou vakcinaci - defektní apoptóza - porucha aktivace T, B lymfocytů a NK buněk T. FREIBERGER, PGS 2021 PID – genetické vyšetření Rodinná anamnéza!!! Osobní anamnéza Fyzikální vyšetření Laboratorní imunologické/biochemické testy Cytogenetické vyšetření Molekulárně genetické vyšetření XLA_pedigr.PNG T. FREIBERGER, PGS 2021 PID – genetické vyšetření Rodinná anamnéza!!! Osobní anamnéza Fyzikální vyšetření Laboratorní imunologické/biochemické testy Cytogenetické vyšetření Molekulárně genetické vyšetření DiGeorge syndrom (FISH) Testy chromozomální instability T. FREIBERGER, PGS 2021 PID – genetické vyšetření Rodinná anamnéza!!! Osobní anamnéza Fyzikální vyšetření Laboratorní imunologické/biochemické testy Cytogenetické vyšetření Molekulárně genetické vyšetření T. FREIBERGER, PGS 2021 VYUŽITÍ METOD MOLEKULÁRNÍ GENETIKY V KLINICKÉ PRAXI ◦MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA PRIMÁRNÍCH IMUNODEFICIENCÍ ◦HLA TYPIZACE ◦MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA U LYMFOIDNÍCH MALIGNIT, DETEKCE MINIMÁLNÍ ZBYTKOVÉ NEMOCI ◦STANOVENI CHIMERISMU U PACIENTŮ PRO TRANSPLANTACI HEMATOPOETICKÝCH KMENOVÝCH BUNĚK ◦MOLEKULÁRNÍ DETEKCE PATOGENŮ ◦GENOVÁ TERAPIE T. FREIBERGER, PGS 2021 PID – molekulárně genetické vyšetření 1. DIAGNOSTIKA GENETICKY PODMÍNĚNÝCH PORUCH IMUNITY 2. GENETICKY PODMÍNĚNÉ FAKTORY MODIFIKUJÍCÍ PRŮBĚH IMUNODEFICIENCÍ T. FREIBERGER, PGS 2021 Převratný vývoj nových technologií T. FREIBERGER, PGS 2021 PCR pcranimatie T. FREIBERGER, PGS 2021 PCR Počet kopií DNA …. 2n x E ◦n … počet cyklů; E … efektivita PCR 30 cyklů … teor. 109 45 cyklů … teor. 1012 T. FREIBERGER, PGS 2021 DETEKCE PCR PRODUKTŮ T. FREIBERGER, PGS 2021 =GELOVÁ ELEKTROFORÉZA ◦ ◦separace: ◦agaróza – horizontální ◦polyakrylamid – vertikální ◦ ◦barvení: ethidium bromide, stříbro, Sybr green ◦ ◦vizualizace: UV světlo (transiluminátor) (ethidium bromide, Sybr green) T. FREIBERGER, PGS 2021 dnaelec2 BTK_050316 specifický produkt PCR dimery primerů marker T. FREIBERGER, PGS 2021 8208417-42cn T. FREIBERGER, PGS 2021 „Varianty“ PCR ◦PCR-SSP, ARMS •PCR se sekvenčně specifickými primery •amplification refractory mutation system ◦RT-PCR •reverzní PCR ◦multiplex PCR ◦real-time PCR ◦ostatní (ACRS…) T. FREIBERGER, PGS 2021 Real-time PCR CMVreal2 T. FREIBERGER, PGS 2021 MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ VYŠETŘENÍ U PID T. FREIBERGER, PGS 2021 Indikace molekulárně genetického vyšetření – metody - Jasný klinický a laboratorní fenotyp – jeden /několik málo kandidátních genů ◦Jedna /několik prevalentních mutací (C2 deficience) ◦jednoduchá PCR ◦Mutace v celém rozsahu genu/ genů (většina PID) ◦screeningové metody s následným Sangerovým sekvenováním ◦Sangerovo sekvenování celého genu ◦cílené masivní paralelní sekvenování – panel genů - Jasný/nejasný klinický a laboratorní fenotyp – více/ mnoho kandidátních genů ◦Mutace v celém rozsahu jednotlivých genů (většina PID) ◦cílené masivní paralelní sekvenování (NGS) – panel genů ◦celoexomové masivní paralelní sekvenování (WES) ◦(celogenomové masivní paralelní sekvenování (WGS)) ◦ ◦ HISTORIE ? - počet genů, velikost genů, urgence... T. FREIBERGER, PGS 2021 Fenotypem „řízená“ genetická diagnostika Bousfiha A et al., J Clin Immunol 2015; 35 :727-738 T. FREIBERGER, PGS 2021 - Jasný klinický a laboratorní fenotyp – jeden /několik málo kandidátních genů ◦Jedna /několik prevalentních mutací (C2 deficience) ◦jednoduchá PCR ◦Mutace v celém rozsahu genu/ genů (většina PID) ◦screeningové metody s následným Sangerovým sekvenováním ◦Sangerovo sekvenování celého genu ◦cílené masivní paralelní sekvenování – panel genů - Jasný/nejasný klinický a laboratorní fenotyp – více/ mnoho kandidátních genů ◦Mutace v celém rozsahu jednotlivých genů (většina PID) ◦cílené masivní paralelní sekvenování (NGS) – panel genů ◦celoexomové masivní paralelní sekvenování (WES) ◦(celogenomové masivní paralelní sekvenování (WGS)) ◦ ◦ HISTORIE ? - počet genů, velikost genů, urgence... Indikace molekulárně genetického vyšetření – metody T. FREIBERGER, PGS 2021 Přímý průkaz mutace pomocí PCR – deficit C2 C2 000512a 190 bp 218 bp T. FREIBERGER, PGS 2021 - Jasný klinický a laboratorní fenotyp – jeden /několik málo kandidátních genů ◦Jedna /několik prevalentních mutací (C2 deficience) ◦jednoduchá PCR ◦Mutace v celém rozsahu genu/ genů (většina PID) ◦screeningové metody s následným Sangerovým sekvenováním ◦Sangerovo sekvenování celého genu ◦cílené masivní paralelní sekvenování – panel genů - Jasný/nejasný klinický a laboratorní fenotyp – více/ mnoho kandidátních genů ◦Mutace v celém rozsahu jednotlivých genů (většina PID) ◦cílené masivní paralelní sekvenování (NGS) – panel genů ◦celoexomové masivní paralelní sekvenování (WES) ◦(celogenomové masivní paralelní sekvenování (WGS)) ◦ ◦ HISTORIE ? - počet genů, velikost genů, urgence... Indikace molekulárně genetického vyšetření – metody T. FREIBERGER, PGS 2021 SSCP - PRINCIP wt DNA mutant DNA denaturace rozdílná migrace jednotlivých denaturovaných vláken DNA na nedenaturujícím PA gelu wt m T. FREIBERGER, PGS 2021 Mutačně screeningové metody DGGE SSCP m wt wt wt wt wt wt m wt T. FREIBERGER, PGS 2021 Sangerovo sekvenování AGG AGT T. FREIBERGER, PGS 2021 Molekulárně genetické vyšetření – vývoj technik - Jasný klinický a laboratorní fenotyp – jeden /několik málo kandidátních genů ◦Jedna /několik prevalentních mutací (C2 deficience) ◦jednoduchá PCR ◦Mutace v celém rozsahu genu/ genů (většina PID) ◦screeningové metody s následným Sangerovým sekvenováním ◦Sangerovo sekvenování celého genu ◦cílené masivní paralelní sekvenování – panel genů - Jasný/nejasný klinický a laboratorní fenotyp – více/ mnoho kandidátních genů ◦Mutace v celém rozsahu jednotlivých genů (většina PID) ◦cílené masivní paralelní sekvenování (NGS) – panel genů ◦celoexomové masivní paralelní sekvenování (WES) ◦(celogenomové masivní paralelní sekvenování (WGS)) ◦ ◦ HISTORIE ? - počet genů, velikost genů, urgence vyšetření... TRENDY T. FREIBERGER, PGS 2021 NEXT GENERATION SEQUENCING APLIKACE Celoexomové/celogenomové sekvenování Cílené sekvenování – panel genů Analýza transkriptomu (RNAseq) Digital gene expression ChIP sequencing Methylome sequencing Small RNA sequencing ngs_SOLID.jpg NGS.gif T. FREIBERGER, PGS 2021 Molekulárně genetické vyšetření – vývoj technik - Jasný klinický a laboratorní fenotyp – jeden /několik málo kandidátních genů ◦Jedna /několik prevalentních mutací (C2 deficience) ◦jednoduchá PCR ◦Mutace v celém rozsahu genu/ genů (většina PID) ◦screeningové metody s následným Sangerovým sekvenováním ◦Sangerovo sekvenování celého genu ◦cílené masivní paralelní sekvenování – panel genů - Jasný/nejasný klinický a laboratorní fenotyp – více/ mnoho kandidátních genů ◦Mutace v celém rozsahu jednotlivých genů (většina PID) ◦cílené masivní paralelní sekvenování (NGS) – panel genů ◦celoexomové masivní paralelní sekvenování (WES) ◦(celogenomové masivní paralelní sekvenování (WGS)) ◦ ◦ HISTORIE ? - počet genů, velikost genů, urgence vyšetření... T. FREIBERGER, PGS 2021 Fenotypem „řízená“ diagnostika - limitace Vysoká heterogenita PID ◦ ◦1 klinický a laboratorní fenotyp – různé geny ◦ ◦1 gen – různé fenotypy ◦různé projevy u nositelů stejné mutace (i v rámci rodiny) ◦gain-of function vs. loss-of-function mutace T. FREIBERGER, PGS 2021 > 1 fenotyp – různé geny X-vázaná agamaglobulinemie AR agamaglobulinemie T. FREIBERGER, PGS 2021 nri1264-f3 T. FREIBERGER, PGS 2021 jeden gen – různé fenotypy De Ravin et al, Blood 2010, 116(8) T. FREIBERGER, PGS 2021 1 gen – různé fenotypy HETEROZYGOTNÍ LOSS OF FUNCTION ztráta inhibičního vlivu na p110d = „gain of function“ p110 delta AD APDS HETEROZYGOTNÍ LOSS OF FUNCTION snížená interakce s IRS SHORT syndrom, AD HOMOZYGOTNÍ LOSS OF FUNCTION ztráta stability = „loss of function“ p110 delta AR AGAMAGLOBULINEMIE mutace PIK3R1 (p85 PIK3) IRS p85 p110 BCR p85 p110d BCR p85 p110d p85 T. FREIBERGER, PGS 2021 Molekulárně genetické vyšetření – vývoj technik - Jasný klinický a laboratorní fenotyp – jeden /několik málo kandidátních genů ◦Jedna /několik prevalentních mutací (C2 deficience) ◦jednoduchá PCR ◦Mutace v celém rozsahu genu/ genů (většina PID) ◦screeningové metody s následným Sangerovým sekvenováním ◦Sangerovo sekvenování celého genu ◦cílené masivní paralelní sekvenování – panel genů - Jasný/nejasný klinický a laboratorní fenotyp – více/ mnoho kandidátních genů ◦Mutace v celém rozsahu jednotlivých genů (většina PID /xGOF mutace) ◦cílené masivní paralelní sekvenování (NGS) – panel genů ◦celoexomové masivní paralelní sekvenování (WES) ◦(celogenomové masivní paralelní sekvenování (WGS)) ◦ ◦ HISTORIE ? - počet genů, velikost genů, urgence vyšetření... TRENDY T. FREIBERGER, PGS 2021 NEXT GENERATION SEQUENCING APLIKACE Celoexomové/celogenomové sekvenování Cílené sekvenování – panel genů Analýza transkriptomu (RNAseq) Digital gene expression ChIP sequencing Methylome sequencing Small RNA sequencing ngs_SOLID.jpg NGS.gif T. FREIBERGER, PGS 2021 Porovnání cíleného a celoexomového sekvenování (WES) TRENDY Cílený panel genů WES Rychlejší, méně nákladné Pomalejší, dražší Lepší pokrytí genů zájmu, delší intronové sekvence Menší průměrné pokrytí, menší záběr intronů Ověřené geny pro danou skupinu onemocnění Možnost objevu nového genu, nečekaných souvislostí Méně variant, snazší interpretace Více variant, obtížnější intepretace První krok Další krok v případě negativního výsledku panelu (ev. > WGS) T. FREIBERGER, PGS 2021 Molekulárně genetické vyšetření – interpretace výsledků - pokročilé technologie (NGS…) – čím dál snažší detekovat mutace ◦ ◦Interpretace ◦Varianty již studované a popsané jako kauzální/ funkčně významné (patogenní) ◦kauzální ◦ ◦Nové varianty – obtížné interpretovat ◦Jsou funkčně významné? – mají skutečně vliv na mRNA, strukturu a/nebo funkci proteinu, fenotyp pacienta ◦ T. FREIBERGER, PGS 2021 WES – filtrování variant Greil J et al. 2013; JACI, 131:1376-83 819,220 SNVs 8,464 non-synonymous SNVs 443 non-synonymous SNVs not in dbSNP 294 non-synonymous SNVs not in 1000GP 143 sample specific non-synonymous SNVs 4 homozygous, non-synonymous SNVs 1 damaging, homozygous stop-gain in CARD11 Intronic? Synonymous? T. FREIBERGER, PGS 2021 Jsou nově detekované varianty funkčně významné? Co pomůže? - výskyt varianty v kontrolní (zdravé) populaci - odpovídající fenotyp, segregace s fenotypem (v rodině) - typ mutace (předčasný stop kodon vs. záměna aminokyseliny) - predikce významu in silico Co je klíčové? - funkční analýzy (- analýza transkriptomu /RNAseq) T. FREIBERGER, PGS 2021 > Kauzalita mutací Pravděpodobně patogenní ◦Nonsense ◦Malé frameshift delece/duplikace ◦Velké delece/duplikace ◦Porušující sestřih mRNA ◦Komplexní ◦ Nejasného významu ◦Missense ◦Malé in-frame delece/inserce ◦Promotorové varianty ◦Tiché substituce ◦Intronové varianty Předčasné ukončení translace a/nebo významná část proteinu chybí } Vliv na - vazbu ligandu? - terciární strukturu? - přenos signálu? - transkripci? - sestřih? - … } T. FREIBERGER, PGS 2021 Thousands of vous Falešně negativní výsledky - mutace není použitými technikami zachycena ◦metody nemají 100% senzitivitu; některé metody navíc nedetekují velké inzerce či delece - mutace leží mimo sledovanou oblast (3` nepřekládaná oblast, introny…) - varianty hodnocené jako VUS mají funkční význam (alternativní sestřih mRNA…) > negativní výsledek nevylučuje diagnózu Správně negativní výsledky - nejedná se o dané onemocnění (= defekt leží v jiném genu) Molekulárně genetické vyšetření – interpretace výsledků LIMITACE T. FREIBERGER, PGS 2021 Falešně pozitivní výsledky ◦ ◦detekovaná změna nemá funkční význam a nesouvisí se vznikem onemocnění ◦selhání metody + nedostatečná kontrola Molekulárně genetické vyšetření – interpretace výsledků LIMITACE T. FREIBERGER, PGS 2021 Vyšetření TREC – screening SCID T. FREIBERGER, PGS 2021 T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) V brzlíku dochází k vytváření unikáních T-buněčných receptorů (TCR) V(D)J rekombinací jednotlivých TCR regionů Vedlejším produktem jsou excisní kroužky DNA (TRECs) Množství TRECs koreluje s počtem naivních T-buněk v krvi qPCR kvantifikace TRECS je vhodný diagnostický marker SCID Převzato z Chase. Curr. Opin. All. Imm. 2010, 10:521–5256 T. FREIBERGER, PGS 2021 T. FREIBERGER, PGS 2021 Kappa-deleting receptor excision circles (KRECs) Obdoba TRECs u vývoje B-lymfocytů Marker vývoje B-buněk, koreluje s množstvím naivních B-buněk Kvantifikace TRECs a KRECs Izolace DNA z krevní skvrny qPCR 10 100 1000 10000 100000 100000 10000 1000 100 10 TRECs / μl IL2RG JAK3 RAG1 Artemis BTK wt T. FREIBERGER, PGS 2021 TREC and KREC copy numbers in dried blood spot samples (DBSS) from anonymized Guthrie cards and retested samples and in patients diagnosed with SCID, XLA, AT, NBS, X-HIGM, CVID, or IgAD. Stephan Borte et al. Blood 2012;119:2552-2555 T. FREIBERGER, PGS 2021 TREC and KREC copy numbers in dried blood spot samples (DBSS) from anonymized Guthrie cards and retested samples and in patients diagnosed with SCID, XLA, AT, NBS, X-HIGM, CVID, or IgAD. Dot size correlates with the amount of ACTB per sample. Dashed lines represent cutoff values for TRECs/μL and KRECs/μL, respectively. Proven molecular defects in the shown SCID patients are depicted as follows: RAG1 indicates recombination activating gene 1; IL2RG, interleukin 2 receptor γ chain (X-SCID); AK2, adenylate kinase 2; IL7RA, interleukin 7 receptor subunit α; JAK3, Janus kinase 3; and uncl., unclassified defect. THM Molekulárně genetické vyšetření je velmi silným nástrojem v diagnostice PID ◦Masivní paralelní sekvenování - panel genů > WES – analýza velkého množství genů v krátkém čase ◦Náročná interpretace výsledků - nález mutace neznamená automaticky, že se jedná o příčinu onemocnění ◦Negativní výsledek nevylučuje danou diagnózu ◦Funkční studie jsou často nezbytné k průkazu vlivu nových mutací na mRNA a/nebo strukturu a funkci proteinu LIMITACE TRENDY T. FREIBERGER, PGS 2021