Krevní barviva Jana Tomanová Upraveno dle prezentace Veroniky Pleškové •Především v kostní dřeni (pro tvorbu hemoglobinu), játrech (tvorba hemoproteinů, cytochromů P-450) http://www.reactome.org/figures/porphyrin_biosynthesis.jpg § §Dědičná, metabolická porucha §porucha funkce kteréhokoliv enzymu syntézy porfyrinů za stupněm ALA a následné hromadění daných metabolitů v některých tkáních • ⇒↑hladina v plasmě a erytrocytech, ↑vylučování stolicí a močí. • §Klinické projevy porfyrií • neurologické - křeče a svalové slabosti, které mohou vést • k částečné obrně (paréze) až ochrnutí (plegie), • zejména rukou • kožní – vysoká zranitelnost kůže, spontánní tvorba puchýřků, • hyperpigmentace a ochlupení v obličeji • abdominální - nevolnost, zvracení, zácpa, kolika • psychické - zmatenost, deprese, úzkost, zapomínání, halucinace • ostatní – anémie, červené zbarvení zubů (Günther), zvětšení • sleziny, červené zbarvení moče, které stáním tmavne • § §Klinické projevy porfyrií • Pozdní kožní porfyrie (PCT) • – vysoká zranitelnost kůže, spontánní tvorba puchýřům hyperpigmentace • - klinická manifestace často iniciována současným jaterním postižením (nadměrná konzumace alkoholu, hepatitida C, vzácně estrogeny) • - neléčená může vést ke vzniku karcinomu jater • • Akutní ataky (AIP) – křečovité až agonizující bolesti břicha • - další příznaky: např. tachykardie, zvracení, křeče • •Pozn.: Důležitá prevence – akutní ataka často vyvolaná použitím léků, kt. nemocní nesmějí dostat • - nutné, aby co nejširší okruh členů rodiny věděl, zda porfyrií trpí či nikoli • - pokud je ale jedinec nositel genu, ale neprodělal klinický záchvat, je dg. na základě fluorescenčních a fotometrických metod obtížná • -> zjišťování genové mutace Místo projevu nemusí být stejné jako místo vzniku (jaterní porfyrie x kožní projevy) AIP – akutní intermitentní porfyrie Dědičné metabolické poruchy způs. Enzym. Deficiencí (většinou monozomálně dědičné = porfyrie Jiné (získané) abnormality porfyrinového metabolismu – např. intoxikace olovem (Pseudoporfyrie – kožní léze podobné jako u porfyria cutanea tarda) http://www.jle.com/en/revues/medecine/ejd/e-docs/00/04/18/FB/texte_alt_jleejd00203_gr1.jpg Hromadění porfyrinů nebo jejich prekurzorů ve tkáních Zvýšená hladina v plazmě nebo Ery Typ porfyrie Enzym Hlavní příznaky Laboratorní nálezy moč stolice krvinky Z deficitu ALA dehydratasy ALA dehydratasa Abdominální bolest, neuropsychické potíže ↑ALA, ↑KOPRO - ↑PROTO Akutní intermitentní (hepatální) Porfobilinogen deaminasa abdominální bolest, zácpa, zvracení, hypertenze a psychické problémy (hysterie), bolesti hlavy ↑ALA, ↑PGB, ↑URO - - Kongenitální erytropoetická Uroporfyrinogen III kosynthetasa fotosenzitivita ↑URO, ↑KOPRO ↑KOPRO ↑URO, ↑KOPRO Porphyria cutanea tarda (hepatální) Uroporfyrinogen dekarboxylasa fotosenzitivita ↑URO, ↑HEPTA ↑KOPRO - Hereditární koproporfyrie (hepatální) Koproporfyrinogen oxidasa fotosenzitivita, abdominální bolest, neuropsychické potíže ↑ALA, ↑PGB, ↑KOPRO ↑KOPRO - Porphyria variegata (hepatální) Protoporfyrinogen oxidasa fotosenzitivita, abdominální bolest, neuropsychické potíže ↑ALA, ↑PGB, ↑KOPRO ↑PROTO, ↑KOPRO - Protoporhyria (erytrohepatální) ferrochelatasa fotosenzitivita - ↑PROTO ↑PROTO Typ porfyrie – podle toho, kde je zvýšená koncentrace porfyrinů (erytrocyty/játra), nesouvisí s místem projevu PCT je jaterní chronická porfyrie způsobená dlouhodobým deficitem enzymu UROD §V kyselém prostředí po ozáření UV světlem (400 nm) silně fluoreskují v červené oblasti (550-650 nm) §HPLC na reverzní fázi s fluorescenční detekcí § §Materiál: konzervovaná (Na2CO3) sbíraná moč (24 h), chráněná před světlem § §Referenční rozmezí: • URO: do 0,050 μmol/24h • KOPRO: do 0,280 μmol/24h • HEPTA: do 0,014 μmol/24h • HEXA: do 0,006 μmol/24h • PENTA: do 0,005 μmol/24h • • • • § Zdroj: TIETZ Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostic, Washington, 2006 • •Anamnéza •Pacient byl přijat pro podezření na porfyrii (poruchu syntézy hemu). Poslední dva roky se mu objevovaly pigmentové skvrny na rukou, byl vyšetřen na kožní klinice, kde na základě kožní biopsie vzniklo podezření na porfyrii. Laboratorně měl pacient opakovaně pozitivní porfyriny v moči. Za hospitalizace byla provedena jaterní biopsie a laboratorní diagnostika protilátek, pacient byl nadále sledován ambulantně. Byla mu doporučena abstinence a nevystavovat se přímému slunci. § §Transportní metaloprotein v červených krvinkách § §Přenos krevních plynů - především O2 z plic do periferních tkání, ale i části CO2 v opačném směru §Důležitý pufrační systém krve – vazba H+ na postranní řetězce His (především v periferní tkáni) § §Koncentrace Hb v krvi se liší podle pohlaví: • ženy: 120-162 g/l • muži: 135-172 g/l § §Tetramer – podjednotky spojeny H-můstky a iontovými vazbami § §Každá podjednotka složena z proteinové části – globinu a prostetické skupiny – hemu s centrálním kationtem Fe2+ (pevně vázán koordinačně kovalentními vazbami) § § několik typů molekul Hb – rozlišujeme podle globinových řetězců (α, β, γ, δ, ε a ζ): • Adultní Hb: • - Hb A1 (2α2β): majoritní forma Hb u dospělých a dětí nad 7 měsíců • - Hb A2 (2α2δ): minoritní forma Hb dospělých, tvoří přibližně 2 % celkového HbA • Fetální Hb: • - Hb F (2α2γ): tvořen u plodu, po narození je odbouráván a nahrazován Hb A; u novorozenců až 70% celkového Hb • Embryonální Hb • - tvořen u embryí buňkami krevních ostrůvků žloutkového váčku v prvních týdnech • vývoje, později je nahrazen Hb F • - Gower I (2ζ2ε), Gower II (2α2ε), Portland (2ζ2γ) § Některé zdroje až 2-3 měsíce zpětně Glyk. Hemogl.: vznik spontánní neenzymatickou vazbou glukózy na hemoglobin. Glykovaný hemoglobin pak přetrvává po celou dobu života Ery (120 dní) Některé zdroje až 2-3 měsíce zpětně Glyk. Hemogl.: vznik spontánní neenzymatickou vazbou glukózy na hemoglobin. Glykovaný hemoglobin pak přetrvává po celou dobu života Ery (120 dní) - v kostní dřeni a erytroblastech (nikoliv v erytrocytech!) vyšší odolnost vůči malárii je způsobená vyšší propustností membrány srpkovitých erytrocytů pro kalium s poklesem intracelulárního K+, což nevyhovuje nárokům Plasmodium falciparum na přežívání §Spektrofotometrické měření – tHb i jeho deriváty mají charakteristická absorpční spektra ve viditelné oblasti záření • ⇒ typická výrazná absorpční maxima v oblasti 400–430 nm • (Soretův pás), další absorpční vrcholy jsou podstatně nižší § § §Stanovení Hb v plné krvi • • - v rámci vyšetření krevního obrazu na hematologických analyzátorech: lýza erytrocytů a tvorba opticky stálého barevného komplexu s lauryl sulfátem sodným nebo • imidazolem • • - v rámci vyšetření acidobazické rovnováhy na ABR analyzátorech: měření absorpce světla v plné krvi • ABL 825 flex (Radiometr) - 1 µl vzorku je ultrazvukově zhemolyzován v kyvetě, vytvoří se tím opticky čirý roztok, měření absorbance • - Drabkinova metoda (referenční): hemolýza, oxidace Fe2+ na Fe3+ hexakyanoželezitanem draselným ([FeIII(CN)6]3-) • za vzniku metHb, který je reakcí s KCN převeden na kyanHb • s absorpčním maximem při 540 nm § §Stanovení derivátů Hb • • - oximetry jsou také součástí ABR analyzátorů • - spektrofotometrická stanovení při různých vlnových délkách • - využití charakteristických absorpčních spekter derivátů • • - oxy-/deoxyHb • - karbonylHb: stabilní maximálně 4 h • - metHb: §Stanovení volného Hb (fHb) v plasmě • • - indikátor intravaskulární hemolýzy (při anemických stavech) • • - Ref. Mez do: 50 mg/l (30 mg/l) • • - šetrný odběr: Li-heparin, centrifugace při 2000ot/min • • - automatický analyzátor: semikvantitativní stanovení, využívá měření sérových indexů (hemoglobin, lipidy, bilirubin), měření absorbance při několika různých vlnových délkách (480, 505, 570, 600, 660 a 700 nm) • • - ruční metoda: spektrofotometrické měření při 340 – 600 nm, absorpční maximum 420 nm • -Sérum tmavě hnědé barvy -BilT = 667,8 μmol/L (2,0 – 21,0 μmol/L) -BilD = 545,8 μmol/L (0,0 – 5,0 μmol/L) -SIH = 0,00 -SIL = 88,00 -SII = 837,00 -fHB = < 50 mg/L kolonoskopický nález Normální Nepokročilý adenom Pokročilý adenom karcinom µg Hb/g 5 – 9 9 - 23 63 - 131 139 – 295 §Stanovení glykovaného hemoglobinu (HbA1c) • - HPLC metoda • §Stanovení Hb ve stolici • - imunochemické vyšetření okultního krvácení (časný projev kolorektálního karcinomu, polypů a dalších onemocnění GT), velmi citlivý test – detekce pouze lidského intaktního Hb z dolní části trávícího traktu (Hb je rychle degradován trávícími enzymy), není ovlivněn potravou • - cut off 15 µg Hb/g (75 ng/ml) • • §Stanovení Hb v moči • - pomocí diagnostických proužků jako součást chemické analýzy moče • §Stanovení Hb, metHb a bilirubinu v likvoru • - diagnostika subarachnoidálního krvácení • - spektrofotometrické měření OxyHb – pozitivní Bilirubin – pozitivní §V retikulo-endoteliálním systému (RES) • ⇒ slezina, kostní dřeň, játra, podkoží • Z-Z (trans) konfigurace stabilizována 6 vodíkovými můstky. Působením světla – přechod na E-E (cis) konfiguraci – rozpustnější (450 nm, fototerapie u novorozenců) •Lineární tetrapyrolové barvivo •Vzniká z uvolněného hemoglobinu při rozpadu erytrocytů •Není jednotná látka - řada tetrapyrolů •Erytrocyty zanikají a hemoglobin metabolizuje ve slezině •Vznik biliverdinu, ten redukován na bilirubin •Bilirubin vázaný na albumin transportován do jater •V játrech extrahován hepatocyty a navázán na kyselinu glukuronovou– stává se ve vodě rozpustným •Konjugovaný bilirubin vylučován žlučovými cestami do tenkého střeva. •Tam redukce na další barevné produkty (urobilinogen, sterkobilinogen) •Část vstřebána zpět do jater - část vylučována močí a stolicí • §Při zvýšené koncentraci v krvi, hyperbilirubinémii, dochází ke žlutému zabarvení kůže a sliznic – ikterus, žloutenka § §Rozdělení hyperbilirubinémií: • • - podle typu bilirubinu: • nekonjugované - při nadměrné tvorbě bilirubinu, ale i při nezvýšené produkci bilirubinu, pokud játra nemají dostatečnou vychytávací nebo konjugační schopnost • konjugované – obstrukce žlučových cest (lithiáza, nádor…) • smíšené - poškození hepatocytů s poruchou vychytávání a konjugace bilirubinu a porucha vylučování konjugovaného bilirubinu do žluče • • - podle vztahu vyvolávající příčiny k játrům: • prehepatální – nadměrný vznik bilirubinu při zdravých játrech, nejčastěji rozpad erytrocytů (ikterus hemolytický) • hepatální – při poškození jaterních buněk • (ikterus hepatální) • posthepatální – nejčastěji při obstrukci žlučových cest (ikterus obstrukční) • • §Referenční intervaly • Celkový bilirubin Věk Koncentrace (μmol/l) 1 den 34-103 2 dny 103-171 3-5 dní 68-137 (Tietz) 1-99 do 21 (Roche) Konjugovaný bilirubin Věk Koncentrace (μmol/l) 0-99 let do 5 (Roche) Pozn. Jádrový ikterus (kernikterus): závažná, nicméně vzácná komplikace hyperbilirubinemie. Vzniká ukládáním nekonjugovaného bilirubinu do mozkové tkáně, bazálních ganglií a mozkového kmene. Přesná hodnota koncentrace bilirubinu, která vede ke vzniku kernikteru není známa. Nejprve se objevují mírné, nespecifické příznaky toxického působení bilirubinu na centrální nervový systém: letargie, problémy s krmením, vysoce laděný pláč a hypotonie. Asi po týdnu se rozvíjí zvýšená dráždivost, opistotonus, křeče, apnoe, hypertonie, teploty. Může vést k rozvoji chronické encefalopatie, ve formě dětské mozkové obrny (atetoidní forma), mentální retardace, dentální dysplazie, poruchy sluchu až hluchoty a paralýzy okohybných svalů. Fototerapie u novorozenců s cílem předejít jádrovému ikteru • •Rutinní metody: Jendrassik – Gróf, fotometrické metody s DCA a DPD • •Jendrassik-Gróf: - reakce s diazotovanou kys. sulfanilovou (činidlo z kys. sulfanilové a dusitanu sodného) • - při stanovení celkového bilirubinu předchází přidání kofeinu + benzoátu) • - vznik azobilirubinu - při slabě kyselém a neutrálním pH červený (absorbční maximum • 440 nm, vadí hemolýza), v silně kyselém pH a • v bazickém prostředízelenomodrý • - po 10 minutách přidat NaOH a vínan sodný, abs. při 600 nm, hemolýza nevadí • - při stanovení přímého bilirubinu reakci zastavit kys. askorbovou • •Referenční metoda: Doumas – Perry (optimalizovaná a specifikovaná metoda Jendrassik-Gróf) • 3 Kopulace bilirubinu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou - tvorba azobilirubinu Fotometrické stanovení • •DPD: - Postupně v praxi nahrazovalo met. Jendrassik-Gróf • - dichlorfenyldiazonium tetrafluoroborát • - Celkový bilirubin v přítomnosti vhodného solubilizačního činidla kopuluje s diazoniovými ionty v silně kyselém prostředí • • - Rychlá reakce dichlorfenyldiazonium tetrafluoroborátu (DPD) s bilirubinem – tvorba azobilirubinu • • Bilirubin + diazoniový iont ----------> azobilirubin • • - intenzita červeného zabarvení přímo úměrná celkovému bilirubinu, fotometrické stanovení • - hemolýza ruší až od vysokých hodnot hemoglobinu • • - v současnosti prakticky jediná používaná metoda • •