Odběr a transport biologického materiálu, vyšetřovací metody v bakteriologii Mgr. Martin Vrba, OKMI FN Brno Specifika odběrů pro bakteriologická vyšetření — Správný výsledek mikrobiologického vyšetření začíná správným odběrem biologického materiálu a jeho správným transportem do mikrobiologické laboratoře! Odběr biologického materiálu — Ze správného místa – např. z okraje rány, z místa akutně probíhajícího zánětu apod. — Ve správnou dobu – např. hemokultury při třesavce, před podáním antibiotik — Opakovaně – zvýší se pravděpodobnost záchytu infekčního agens — Zabránění kontaminace Odběr biologického materiálu — Odběry do komerčních odběrových souprav — Pro různé materiály různé odběrové soupravy — Správná identifikace materiálu Obecné zásady transportu — Co nejrychleji po odběru do laboratoře — Stěry na suchém tampónu a moče do 2 hodin po odběru Uchování materiálu — Pokojová teplota: — Stěry a výtěry v transportní půdě — Hemokultury — Likvory — Hnisy a punktáty — Chladničková teplota (4-8°C): — Moč — Stolice na průkaz toxinu C.difficile — Krev na sérologická vyšetření Stěry a výtěry — Výtěr z krku, nosu, ucha, oka, z rány, z kůže, z konečníku, z uretry, z pochvy atd. — Sterilní vatový tampon — Suchý – zpracování do 2 hodin po odběru — S transportní půdou — bez aktivního uhlí — s aktivním uhlím — Možnost uchování až 24 hodin při pokojové teplotě Stěry a výtěry — Co nejdříve zpracovat v laboratoři — Bez mikroskopie — Anaerobní kultivace Odběrová souprava Sputum — Odběr ráno, na lačno, někdy po provokaci expektorace — Sterilní široká zkumavka ,,sputovka“ — Ne sliny, ale sputum z dolních cest dýchacích — Nutno zpracovat do 2 hodin po odběru — Uchování při pokojové teplotě Odběrová souprava Sputum - zpracování — Mikroskopie — Kultivace semikvantitativní — Postupné ředění sputa ^— Signifikantní nález v ředění 10^-7 ^— pro semikvantitativní vyšetření se nehodí sliny – zavádějící výsledek^ Moč — Odběr většinou ráno — Odběr za aseptických podmínek po předchozím umytí, případně dezinfekci do sterilní užší zkumavky — První porce při zánětech močové trubice — Střední proud při infekci močového měchýře — Poslední porce při infekcích prostaty a vyšších etáží močové soustavy Odběr moče — 5 – 7 ml moči — Uchování při chladničkové teplotě — Zpracovat do 2 hod po odběru — Vysoké riziko kontaminace Zkumavky na odběr moče Vyšetření moče — Semikvantitativní — Vyočkování kalibrovanou kličkou 1 µl — Postupné ředění a vyočkování moče — Přístrojové vyhodnocení množství leukocytů a bakterií — Signifikantní množství 10^5/ml Hnis, punktát — Tekutý materiál vždy, pokud je to možné — Mikroskopie — Širší škála kultivačních půd — Odběr pomocí stříkačky — Transport — Ve stříkačce bez přístupu vzduchu — Ve sterilní zkumavce — Uchování při pokojové teplotě Odběr tkáně — Odběr za aseptických podmínek — Odběr do sterilní širší zkumavky — Uchování při pokojové teplotě Likvor (mozkomíšní mok) — Odběr asepticky lumbální punkcí nebo z drénů — Transport ve sterilní zkumavce s pevným uzávěrem — Odběr 2 – 3 ml likvoru — Uchování při pokojové teplotě — Možnost odběru a transportu v lahvičce na hemokultury Krev — Hemokultivace — Odběr pro sérologická vyšetření průkazu protilátek Odběr krve na hemokultivaci — Diagnostika sepse — Odběr — při nárůstu teploty, při třesavce — Při kontinuální teplotě kdykoli — Vždy venepunkcí — Při přítomnosti katetru zároveň venepunkcí i z katetru, možnost diagnostiky katetrových sepsí — Odběr za aseptických podmínek Odběr krve pro hemokultivaci — Počet odběrů – 2 – 3x denně — Kultivace aerobní a anaerobní — 5 – 10 ml krve u dospělých, — 0,5 – 3 ml krve u dětí — Uchování při pokojové teplotě Lahvičky pro odběr, transport a kultivaci hemokultur Stolice — Výtěr z konečníku do transportní půdy na obligátní střevní patogeny — Kousek stolice pro parazitologické vyšetření do širší zkumavky, nemusí být sterilní — Odběr kousku stolice pro průkaz toxinu Clostridium difficile — Lepex – otisk perianálních řas na lepící pásku, průkaz vajíček roupů Urogenitální trakt — Výtěr z uretry — Výtěr z pochvy — Výtěr z cervixu — Při podezření na GO i výtěr z rekta a krku (transportní půda) Urogenitální trakt — Výtěr do transportní půdy — Běžná aerobní kultivace — Anaerobní kultivace — Kultivace na GO — Diagnostika Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis — Kultivace kvasinek Urogenitální trakt — Výtěr z pochvy doplnit nátěrem na 2 skla — Nátěr nechat zaschnout, nefixovat, nelepit — Mikroskopický průkaz infekce nebo změny ve složení vaginální flóry — Přítomnost leukocytů — Přítomnost laktobacilů — Možnost barvení na Trichomonas vaginalis Odběry pro mykologická vyšetření — Šupiny kůže z okraje ložiska sterilním skalpelem do sterilní zkumavky — Mokvající plochy – stěr do transportní půdy — Nehty – seškrab sterilním skalpelem z okraje ložiska Odběr k vyšetření molekulárně – genetickou metodou (PCR) — Tekutý materiál — Stěr suchým vatovým tampónem — Odběr bez příměsí chemických látek (heparin, agar) Vyšetřovací metody v mikrobiologii — Přímý průkaz – průkaz přítomnosti bakterií nebo virů– bakteriologie, virologie — Nepřímý průkaz – průkaz reakce makroorganizmu na přítomnost bakterií nebo virů - sérologie Vyšetřovací metody v bakteriologii — Mikroskopie — Kultivace — Průkaz antigenů — Průkaz metabolitů — Průkaz nukleových kyselin Mikroskopie — Preparát nativní — Preparát barvený — Barvení dle Grama — Barvení dle Giemsy — Barvení dle Ziehl – Nielsena Nativní preparát — Suspenze materiálu nebo kultury ve fyziologickém roztoku — Pro pozorování živých mikroorganizmů, posouzení jejich pohyblivosti — 100 – 400násobné zvětšení — Využití: — bakteriologie – sledování typického pohybu bakterií (listerie, cholera) — parazitologie – průkaz střevních parazitů ve stolici — mykologie – sledování růstu a množení kvasinek Nativní preparát –pučení kvasinek Barvení podle Grama — Hans Christian Joachim Gram, 1884 — Dělí bakterie do dvou základních skupin dle složení buněčné stěny (Gram pozitivní a Gram negativní) — Mikroskopie při 1000násobném zvětšení s použitím imerzního oleje mezi preparátem a objektivem Barvení podle Grama - postup — Zhotovení nátěru na sklíčko — Fixace plamenem nebo metanolem — Barvení: — Krystalová violeť (20 - 30 s) — Lugolův roztok (20 - 30 s) — Oplach vodou — Odbarvení acetonalkoholem (10 s) — Safranin (1 min) Barvení podle Grama G+ koky ve dvojicích G- tyčinky Barvení podle Grama - význam — Diagnostické barvení – základ klasifikace a taxonomie bakterií — Možnost okamžité a racionální antibiotické terapie Barvení podle Giemsy — Slouží k diferenciaci buněčných struktur — Použití hlavně v parazitologii: — Mikrobiální obraz poševní – průkaz Trichomonas vaginalis — Diagnostika malárie — Barvení obtížně barvitelných mikroorganizmů — Fixace metanolem Barvení podle Giemsy — Azur a eosin rozpuštěný ve směsi glycerinu a metanolu — Ředěn neutrální destilovanou vodou — Roztok není stabilní, používá se vždy čerstvý Barvení podle Giemsy Barvení podle Ziehl - Nielsena — Barvení acidorezistentních tyčinek — Špatně barvitelné — Vysoký obsah lipidů v buněčné stěně — Nejčastěji Mycobacterium sp. Barvení podle Ziehl - Nielsena — Fixace teplem — Barvení karbolfuchsinem — Zahřátí — Odbarvení kyselým alkoholem — Oplach vodou — Dobarvení malachitovou zelení Barvení podle Ziehl - Nielsena Kultivační průkaz — Základní mikrobiologický postup — Cílem je získat mikroba z klinického materiálu v čisté kultuře — Identifikace mikroba — Určit citlivost k antibiotikům Kultivační půdy — Dělení podle konzistence: — Tekuté – k pomnožení bakterií — Polotuhé – ke sledování pohybu bakterií — Tuhé, pevné Kultivační půdy — Dělení podle funkce: — Základní – masopeptonový bujon, krevní agar — Diagnostické – obsahují látky, které se mění vlivem metabolizmu bakterií (např. štěpení laktózy) — Selektivní – k výběrovému růstu bakterií, obsahují látky, které potlačují některé bakterie — Selektivně diagnostické Kultivační půdy — Dělení podle funkce (pokračování) — Transportní - k transportu (bez množení) – umožňují přežití bakterií při transportu — Pomnožovací – tekuté, k pomnožení bakterií ve vzorku, mohou být i selektivní Podmínky kultivace — Dostatečná vlhkost prostředí — Optimální teplota: 37°C (4°C, 42°C) — Optimální pH půdy: 7,2 – 7,4 — Vhodná izotonie média: 0,5 – 1% NaCl — Dostatek vhodných živin — Vhodné plynné prostředí Dělení bakterií podle vztahu ke kyslíku — Striktně aerobní — Fakultativně anaerobní — Striktně anaerobní — Anaerobní aerotolerantní — Mikroaerofilní — Kapnofilní Nádoba pro anaerobní kultivaci Anaerostat Termostat se zvýšenou tenzí CO[2] Hlavní druhy kultivačních půd — Masopeptonový bujon — Krevní agar — Čokoládový krevní agar — MacConkey agar — Sabouraudův agar — XLD agar (xylóza – lyzin - deoxycholát) — Mueller – Hintonův agar — Chromagary Masopeptonový bujón Krevní agar – nárůst S.aureus MacConkey agar a krevní agar nárůst E.coli XLD agar – nárůst Salmonella sp. Karmali agar - nárůst Campylobacter sp. Identifikace bakterií — Podle morfologie — Podle růstových vlastností — Hmotnostní spektrometrie – metoda MALDI TOF — Podle biochemických vlastností — Selektivní půdy — Komerční diagnostické soupravy — Podle antigenní struktury — Latexová aglutinace Biochemické určení bakterií Stanovení citlivosti na antibiotika — Disková difúzní metoda — Difuze antibiotik z disků do půdy a zábrana růstu bakterií — Diluční testy — Stanovení koncentrace antibiotika, která je ještě na mikroba účinná Disková difúzní metoda Diluční metoda – mikrotitrační destičky Diluční metoda – E-test Průkaz antigenů z materiálu — Latexová aglutinace vyšetření likvoru, moče — Imunochromatografie vyšetření moče – Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae vyšetření stolice - Clostridium difficile, střevní viry, Helicobacter pylori Latexová aglutinace Imunochromatografie Průkaz metabolitů — Těžko kultivovatelné bakterie — Rychlý průkaz — Např. infekce Helicobacter pylori průkaz produkce ureázy Průkaz nukleových kyselin — Průkaz přítomnosti nukleové kyseliny mikroorganizmu v klinickém vzorku — Druhová identifikace izolovaného mikrobiálního kmene