HOMEOSTAZA
Dokonalá rovnováha několika systémů:
• endotel cévní stěny
• kolagen ležící pod endotelem
• tonus cév
• počet a kvalita krevních destiček
• srážlivé a fibrinolytické systémy
• charakter proudění v cévě
brání jak krvácení, tak intravaskulárnímu srážení krve
HEMOSTÁZA (zástava krvácení)
= soubor mechanismů, které na jedné straně brání vzniku krvácení, na straně druhé staví krvácení již vzniklé
• Reakce cév v místě poranění
•Reakce tkáně v místě poranění - zvýšený tlak tkáně
• Činnost krevních destiček
• Srážení krve
REAKCE CÉV
Vasokonstrikce.
Stupeň vasokonstrikce závisí na stupni poškození cévy. Serotonin a tromboxan A2 z destičkových granul. Adrenalin.
Trombin - stimulace endotelu a sekrece endotelinu-1.
Funkce destiček
• Ochrana organismu před ztrátou krve
• Udržování integrity cévní stěny a hojení poranění cév (destičkový růstový faktor z a-granul)
• Zánětlivé reakce, změny permeability kapilár, odstraňování cizorodých látek, virů, bakterií, odvržení transplantátu...
• Nosič pro různé látky absorbované na povrch destiček
KREVNÍ DESTIČKY (TROMBOCYTY)
Bezjaderné, bezbarvé, granulované, nejmenší formované elementy krevní.
Vznik: megakaryocyty kostní dřeně pod vlivem kolonie stimulujících faktorů - interleukinů [ÍL-1, IL-3, IL-6) a granulocyty a makrofágy stimulujícího faktoru (GM-CSF)
Počet: 200 000 - 500 000 v ml, z toho třetina ve slezine a dvě třetiny v cirkulaci
Žádné věkové ani pohlavní rozdíly v počtu.
Trombocytoza - po splenektomii.
Velikost: 2-4 jlliti průměr, 0,5 - 1 jlliti tloušťka, 4 - 8 fl objem
Tvar: hladké, okrouhlé disky
Tvar udržován cytoskeletem - prstenec mikrotubulů kolem periferie, silně invaginovaná membrána, kanalikulární systém spojený s extracelulárním prostorem.
Membrána: obsahuje receptory pro přilnutí na vhodné povrchy, např. kolagen, von Willebrandův faktor, fibrinogen
Cytoplasma: obsahuje aktin, myosin, glykogen, lysozomy a
Granula:
denznígranula (neproteinové substance - serotonin, ADP, adenonukleotidy) a a granula (proteinový obsah: faktory srážení, destičkový růstový faktor - PDGF)
Glykokalyx: 10-50 nm, směs bílkovin a mukopolysacharidů (faktory systému srážení, ionty, AM K, histamin, léky...)
Stavba trombocytů
ZÁSTAVA KRVÁCENÍ I. - bílý trombus
Adheze
- Negativní náboj na povrchu trombocytů a endotelu (proteoglykany, heparan sulfát)
- Obnažení cévní stěny - kolagen a proteiny extracelulární matrix
- Receptory pro kolagen a další na trombocytů (integriny)
- von Willebrandův faktor (endotel, megakaryocyty, trombocyty) a jeho sekrece pod vlivem cytokinů a hypoxie - vazba na GP Ib/la
- Kolagen - Gp la/lia
- Fibronektin, laminin - Gp lc/lla
Ligandy a receptory zapojene do adheze trombocytu
Gplb-V-IX        a2p! GPVI
Podoplanin VWF
FibrotiecMn Fibrinogen
CLEC-2
Flbronactin Thrombospondin Fibronectin Laminin Vitronectin
AkM/2
PLDi
PLC72
t t
Ca!DAG-GEF1
f t
—
PKD2
CaCAMK
Integrin activation
Shape change
Secretion
-* |PrR
• i
STIMl/Orail
TMEM16F
Procoagulant activity
64
Aktivace a změna tvaru, degranulace
- Vazba ligandů (kolagen, ADP, trombin) na příslušné receptory
- Iniciace signálních kaskád a buněčné odpovědi - aktivace trombocytů
- Následná degranulace trombocytů (exocytóza)
- Denzní granula - ATP, ADP, serotonin, Ca2+
- a granula - vWF, faktor V, fibrinogen
- Aktivace COX a uvolnění tromboxanu A2
- Změny cytoskeletu a tvaru trombocytů
V XIII
Vasokonstrikce
Agregace
Amplifikace odpovědi po vazbě ligandů - nábor dalších trombocytů
ADP (P2Y12 receptory), serotonin, tromboxan A2 Uvolněný vWF se váže na příslušné receptory - nábor dálích trombocytů a „vazba" mezi trombocyty Konformační změna receptoru Gp llb/llla - vazba fibrinogenu Formace trombu
Závěrečná fáze - obnažení a uvolnění fosfolipidů (serotonin, TXA2) a za přítomnosti vápenatých iontů (uvolněných z trombocytů) dochází k aktivaci koagulační kaskády
Inhibice
Fibrinogen vWF
Abcixim
Receptor llb/llla
AGREGACE
IP
Gs
I
AC
Ligandy a receptory trombocytü
sprazene s G prot.
PGL Epi
a2A
PGE2
EP3
AAA
I
Gz AC
win
Gi
1
AC
pkaG
AD P
P2Y
Gl
1\
AC PI3K
MLC
• I
• ■
t t
CalDAG-GEFI
t
PKD2
Thrombin
PAR 1/4
ADP
P2Y,
G12V13 Gq
\
RhoA
Gq
CaCAMK
TvAg      Serotonin ATP
TP
I jft. .-PSj vV H A tffr .1^ II .Fh irä
Gq
5HT-2A
P2X, La I
Gq
Ca2+
PLCT2...........................IP3-R
-.............................L...................................
T t
........................STtMl/Ofatl
TMEM16F
1 1 1 1
t
3
Integrin activation
Shape change
Secretion
Procoagulant activity
08
ZÁSTAVA KRVÁCENÍ I. - bílý trombus -
přehled a návaznosti
O • K Q
Resting Shape Integrin Secretion Procoagulant activity
change activation
ZÁSTAVA KRVÁCENÍ II. - červený trombus
V klasickém pojetí se tvorba červeného trombu sestává ze dvou systémů - Vnitrní systém - vnější systém aktivace faktoru X.
Vnitřní - kontakt krve s negativně nabitým povrchem - povrch trombocytů
Vnější - kontakt s poškozenými buněčnými membránami - membránově vázaný tkáňový faktor
Následuje aktivace faktorů - kaskáda dějů - často zymogeny, aktivované faktory - serinové proteázy = kontrolovaná proteolýza
Finálními kroky jsou aktivace společného systému, vznik trombinu a polymerního fibrínu.
Protrombin (faktor X) - trombin
- sled enzymových reakcí
- anionické fosfolipidy (membrány trombocytů), vápenaté ionty
Fibrinogen - fibrin monomer - fibrin polymer (stabilizace, faktor III, Ca2+).
Prokoagulační faktory
Faktor	Název faktoru	Biologický poločas (h)
1	fibrinogen	120-144
II	protrombin	48
III	tromboplastin, trombokináza	velmi krátký
IV	ionty vápníku	
V	proakcelerin	12-15
VII	(AHF) prokonvertin, stabilní f.	2-5
VIII	antihemofilní faktor A, a. globulin	5-12
IX	Christmas faktor, antihem. f. B	12-30
x	Stuart-Prower faktor	32
XI	antihemofilický f. C, PTA	méně než 12
XII	Hageman faktor	méně než 12
XIII	f. stabilizující fibrin	48-72
HMW-K	Fitzgerald f. (vysokomolekulárni kininogen)	
Pre-K	prekallikrein	
Ka	kallikrein	
PL	destičkové fosfolipidy	
Proteiny koagulační kaskády mají typickou doménovou strukturu. Signální peptid Propeptid EGF-like doména Kringle (smyčka) doména
Katalytická doména
Propeptidová doména je bohatá na zbytky kyseliny glutamové - y-karboxylace (vitamín K) a vazba vápenatých iontů
Vnitřní cesta
Intrinsic
surfacc contact
I
XII
XI
IX
XII =
1
XI.
XII - Hagcman factor, a serine protease XI - Plasma thromboplastin, antecedent serine protease IX - Christmas factor, serine protease VII - Stable factor, serine protease
XIII - Fibrin stabilisingfactor, a transglutaminase PL - Platelet membrane phospholipid Ca'-- Calcium ions
TF - Tissue Factor (a =activeform)
Extrinsic
TF:VII:
■» IX.
(VIII, PL,ica-)
x —^ xa *■
(V, PL,|Ca" prothrombin->
I
tissue damage
Common
thrombin
(serine protease)
I
fibrinogen ->- fibrin
XIII XIII
•1
stablefibrin clot
Faktory IXa, Xa a trombin proteolyticky štěpí faktor VIII za vzniku Vlila, který je kofaktorem další reakce.
Vlila spolu s Ixa, vápenatými ionty (z destiček) a negativně nabitými fosfolipidy vytváří trimolekulární komplex tenázu. Ten á za konvertuje faktor X na Xa.
Faktor Xlla konvertuje prekallikrein na kallikrein, který zpětně katalyzuje a urychluje konverzi leaktivního faktoru XII na Xlla - příklad pozitivní zpětné vazby.
Vnější cesta
Intrinsic
surfacc contact
I
XII
XI
IX
XII,
I
XI.
XII - Hageman factor, a serine protease XI - Plasma thromboplastin,antecedentserine protease IX - Christmas factor, serine protease VII - Stable factor, serine protease
XIII - Fibrin stabilisingfactor, a transglutaminase PL - Platelet membrane phospholipid Ca--- Calcium ions
TF - Tissue Factor (a -activeform)
1
Extrinsic
■» ix.
(VIII, PL, ...Ca")
x -> K <-
(V PL, i Ca")
prothrombin->
TF:Vlla<_
I
tissue damage
X
Common
thrombin
fibrinogen
(serine protease)
I
XIII XIII
•1
fibrin
stable fibrin clot
Zahájena faktory mimo cévní systém Exprese tkáňového faktoru mimo cévy Ten je receptorem pro plasmatický protein -faktor VII
Aktivace - vznik Vila Spolu s vápenatými ionty vznik trimolekulárního komplexu, který se podobá tenáze Proteolytická aktivace faktoru X
Společná cesta
Intrinsic
surfacc contact
i
XII
XI
XII,
I
XI.
XII - Hageman factor, a serine protease XI - Plasma thromboplastin, antecedentserine protease IX - Christmas factor, serine protease VII - Stable factor, serine protease
XIII - Fibrin stabilisingfactor, a transglutaminase PL - Platelet membrane phospholipid Ca--- Calcium ions
TF - Tissue Factor (a -activeform)
IX
1
Extrinsic
(VIII, PL, Ca")
X ->   X <r
(V, PL, iCa") prothrombin->
TF:Vlla<_
I
tissue damage
X
Common
fibrinogen
thrombin serine protease
I
XIII ->
XIII
•I
fibrin
stable fibrin clot
Zahájena faktorem Xa Následná aktivace faktoru Va Tvorba
trimolekulárního komplexu (Xa, Va, vápenaté ionty spolu s PL) = protrombináza Konverze protrombinu na trombin Konverze fibrinogenu na fibrin
Trombin
- Trombin katalyzuje konverzi proteolýzu fibrinogenu (vznik fibrinopeptidů A a B) - a, (3, y
- Monomery fibrinu spontálně polymerizují a tvoří gel - zachycení krevních elementů
- Aktivace faktoru XIII a vznik polymerní sítě
- Trombin katalyzuje vznik dalšího trombinu a Va a Vlila - pozitivní zpětná vazba
- Parakrinní působení trombinu - endoteliální buňky uvolňují NO, prostaglandin l2, ADP, vWF, TPA - trombocyty (PAR-1) - spojení trombocytů s koagulační kaskádou
Moderní pojetí - fáze koagulace
1. Iniciační fáze
• = vnější cesta, expozice TF a následká kaskáda
2. Amplifikační fáze
• Akumulace trombinu (pomalá)
• Nábor dalších trombocytů v místě poranění cévy
• Vznik Va a amplifikace protrombinázové aktivity
3. Propagační fáze
• Na povrchu prokoagulačních fosfolipidů - trombocytů
• Kaskáda se vznikem trombinu, fibrínu a jeho polymerizace -zesíťování
Moderní pojetí
Fibrín (I) XIHa
INTRAVASKULARNI KOAGULACE
Poškození endotelu způsobené:
1) Aterosklerosou (infarkt myokardu, cévní mozková příhoda)
2) Zánět (žilní trombosa, plicní embolie)
THROMBOSIS
4 Thrombus
Example: Ml
Stroke
Example:
Pulmonary embolism
III
damaged endothelium
Stasis
I
Inflammation/activation
Vcsscf wall
PÉateÉets
Adhesion molecules
Mícropartícles
Monocytes
11
TF
TF
FXIIa
Extrinsic coagulation
Liver-derived coagulation factor level and function
Mechanismus vedoucí ke vzniku trombů - hypoxická aktivace endotelu a exprese adhezních proteinů typu P-selektinu. Ten je signální molekulou pro cirkulující monocyty, neutrofily, trombocyty a mikročástice a indukuje jejich vazbu k povrchu endotelu s následným uvolněním faktorů (TF, NETs) a iniciací vnější a vnitřní cesty koagulace.
RIZENI HEMOKOAGULACE
Hemokoagulace vyvažována protisrážlivými mechanismy: Nehumorální řízení:
Souvislý neporušený endotel.
Proud krve: omezení zvětšování koagula, zředění a odplavení faktorů srážení krve.
Vzájemné negativní působení tromboxanu A2 a prostacyklinu.
Humorální řízení:
Fibrin: silně váže trombin - „antitrombin"
Antitrombin III: cirkulující inhibitor proteáz (aktivních forem faktorů IX, X, XI, XII), vazba na proteázy koagulačního systému usnadněna heparinem pocházejícím ze žírných buněk (kofaktor heparinu)
Trombmodulin: trombin vážící protein, produkován endoteliálními buňkami
Trombin + Trombmodulin = aktivátor proteinu C
Protein C: inaktivace faktorů V a VIII
inhibice inhibitoru aktivátoru tkáňového plasminogenu
(=více plasminu - rozklad fibrinu)
Protein S: kofaktor proteinu C
Plasmin (fibrinolysin): aktivní složka fibrinolytického systému. Prekurzor: plasminogen, katalýza trombinem a tkáňovým aktivátorem plasminu (TPA) - využití v terapii infarktu myokardu!!! Streptokináza.
Inhibitor tkáňového faktoru (TFPI): plazmatický protein asociovaný s membránou endoteliálních buněk, komplex s Vila a vápenatými ionty - inhibice proteázové aktivity Vila („antitrombotický povrch cév")
Parakrinní antikoagulační faktory
- PGI2 - vazodilatace - buňky endotelu
-   Tok krve, inhibice aktivace trombocytů
- Oxid dusnatý - endoteliální buňky, inhibice adheze a agregace trombocytů
FAVOR THROMBOSIS
E*tnnw cbagu! a tion
\
Exposure ol menTbrane-bourvd Msuetactot
INHIBIT THROMBOSIS
Proteolysis Of factors Va ana Vitia
Protein C
latfo« Vila and Xa
cascade 4
rtjgjegation j
PGtj. MO. anfl adenosine
Cofla^n
moleftjS*
Ttesoc lactcr patnway inhibitor
Fibrinolytické faktory
- t-PA - serinová proteáza, hydrolýza plazminogenu a vznik plazminu (endotel)
-  Katecholaminy a bradykinin zvyšují hladiny cirkulujícího t-PA
- u-PA - serinová proteáza urokinázového typu (plasma)
- u-PAR - receptor pro u-PA
- Plasminogen - plasmin (játra)
- PAI-1 - inhibitor aktivátoru plasminogenu, plasma a trombocyty
- PAI-2 - jen těhotenství (placenta) - zvýšený risk trombózy během těhotenství?
- a2-antiplasmin - játra, ledviny - vazba plasminu (1:1) a jeho inaktivace
or
u-PÄTu-pA?
Plasminogen
Plasmin
PAI-1 PAI-2
Stable fibrin
Fibrin
breakdown products
TROMBOLYZA
Tissue plasminogen activator (tPA)
t
Plasminogen activator inhibitor 1 & 2
Urokinase
PLASMINOGEN A-
THROMBI
PLASMIN
Factor Xla, Xlla Kallikrein
Q2-antiplasmin
a2-rnacroglobulin
FIBRIN    X    FIBRIN DEGRADATION
PRODUCTS
1
Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor
UPA, urokinase plasmin activator tPA, tissue plasmin activator PAI, plasmin acivator inhibitor      alpha2PI-Plasmin, complex
ANTI KOAGULACE
Defibrinace: odstranění fibrínu (preparáty z hadích jedů) - in vitro
Dekalcifikace: vyvázání nebo odstranění vápenatých iontů (citrát sodný, šťavelan draselný nebo amonný) - in vitro Heparin: přirozené antikoagulans, žírne buňky, účinné pouze za přítomnosti antitrombinu III, také in vivo Kumarinové deriváty (dikumarol, warfarin): inhibice účinků vitamínu K v játrech - poruchy faktorů II, VII, IX, X, proteinu C, proteinu S (usnadňuje aktivaci Va a Vlila pomocí proteinu C) Hirudin: obsolentní, slinné žlázy pijavek (Hirudo medicinalis)
Pozn. Vitamín K a jeho antagonists
Vitamín K
- Podporuje v játrech karboxylaci glutamátových zbytků v prekurzorech některých faktorů (II, VII, IX a X) a některých antikoagulačních faktorů za vzniku gama-karboxyglutamátu
- Karboxylové skupiny nutné pro vazbu na povrch fosfolipidů, která je zprostředkována vápenatými ionty
Strukturální analoga vitamínu K = 4-hydroxykumariny = „falešný vitamín K"
- Fenoprokumon, warfarin
- Nutné hledání optimální dávky pro každého pacienta zvlášt
- Kontroly, hodnoty INR
- Výhoda = je antidotum (= vitamín K)
NAEKPJH NAD(P)-
vitamin K - ~3-epox:de
Fig. <15). The role of vitamin K in coagulation.
Převzato. Babula, P. et al. Noteworthy Secondary Metabolites Naphthoquinones - their Occurrence, Pharmacological Properties and Analysis. Current Pharmaceutical Analysis, 5(1), 2009.
Pozn. Heparin a hirudin a jejich
deriváty
Heparin
- Zdrojem je střevní sliznice vepřů
- Antikoagulační schopnost závisí na délce řetězců
• Nefrakcionovaný standardní heparin (4000-40000 Da)
• Nízkomolekulární frakcionovaný heparin (cca 5000 Da, certoparin, dalteparin, enoxaparin)
• Syntetické deriváty (fondaparinux)
• Aktivace antitrombinu III
- Reverzibilní inaktivace trombinu a dalších koagulačních faktorů
Hirudin a jeho deriváty
- Zdrojem jsou sliny pijavice Hirudo medicinalis
- Blokují aktivní centrum trombinu
- Lepirudin, desirudin
A ■
O O    I OH
Vyšetření krevní srážlivosti
vnitrní
cesta
vnejsi cesta
warfarin
Dekalcifikovaná plasma kaolin-kefalinový komplex + přebytek vápenatých iontů Kefalin nutný pro aktivaci faktoru X ^| („náhražka destičkových^ fosfolipidů")
- Dekalcifikovaná plasma
- Tkáňový tromboplastin + přebytek vápenatých iontů
- Dekalcifikovaná plasma
- Trombin + přebytek vápenatých iontů
aPTT - Aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT), 28 - 40 s
Quick - rychlost přeměny protrombinu na trombin 12 - 15 s; International Normalized Ratio 0,8 -1,2
TT - trombinový čas 17 - 24 s
Pozn. FDP (fibrinové degradační produkty) a D-dimery = markery koagulace s následnou fibrinolýzou
# fibrín #
Streptococci
Source: Fauci AS, Kasper DL, Braunwald E, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL, Loscalzo J: Harrison 's Princip/es of Interna/ Medicine, 17th Edition: http://www.accejsnnedicine.com
Copyright © The McGraw-Hill Companies, Inc. All rights reserved.
- Beta-hemolytický streptokok
- Konverze plasminogenu na aktivní plasmin;
- Terapie tromboembolických stavů
PORUCHY HEMOSTAZY
Krvácivé stavy = chorobné stavy u kterých vznikají krvácivé projevy buď spontánně nebo po neúměrně malém podnětu. •Vasogenní poruchy krevního srážení •Trombocytární krvácení:
ljtrombocytopenie
2)trombocytopatie •Koagulopatie - chybění nebo nedostatek plazmatických koagulačních faktorů:
1) Poruchy syntézy: dědičné (hemofílie), získané (karence vitamínu K, terapie deriváty kumarinu)
2) Poruchy přeměny:
•konsumpční koagulopatie a hyperfibrinolýza
•mnohočetné transfuze
• imunokoagulopatie
•terapie heparinem
•paraproteinemie