PŘÍPRAVA CHROMOSOMOVÝCH PREPARÁTŮ METODAMI KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracovala Mgr. Navaříková vytvořilo CMBG FN Brno [USEMAP] VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ VROZENÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT •postnatální materiály: periferní krev •prenatální materiály: plodová voda, choriové klky, • krev plodu, kůže potracených plodů • kůže, placenta 011 nasazení plodovky 001 [USEMAP] VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABNORMALIT U ONKOLOGICKÝCH PACIENTŮ • • kostní dřeň solidní nádory periferní krev dřeň 002 nádory 003 [USEMAP] VSTUPNÍ MATERIÁLY K VYŠETŘENÍ ZÍSKANÝCH CHROMOSOMOVÝCH ABERACÍ VZNIKLÝCH V DŮSLEDKU PŮSOBENÍ MUTAGENNÍCH FAKTORŮ PROSTŘEDÍ NA ČLOVĚKA •postnatální materiál: periferní krev • • [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY •odběr materiálu – STERILNÍ ODBĚR! •kultivace – získání dostatečného množství dělících se buněk • (s chromosomy), zastavení dělení buněk kolchicinem •zpracování suspenze (hypotonizace, fixace) – získání suspenze buněk •vykapání na podložní sklíčka •pruhování / barvení chromosomů •hodnocení ve světelném mikroskopu • [USEMAP] ODBĚR MATERIÁLU [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu • Odběr materiálu pro účely cytogenetického • vyšetření, vždy za sterilních podmínek!!! • •do heparinu (nesrážlivá krev)– periferní krev, krev plodu (obv. 3 ml) •do heparinu a transportního média – kostní dřeň • (obv. 1-2 ml) •do transportního média – solidní tumory, kůže (obv. 1x1 cm), choriové klky (obv. 20 mg) •bez přídavku média a dalších látek – plodová voda • (obv. 20 ml) [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY odběr materiálu •Odběr materiálu pro cytogenetickou analýzu a typy buněk, které •jsou v konkrétním materiálu vhodné pro získání metafázních •chromosomů : •periferní krev – ze žíly – T-lymfocyty •fetální krev – z pupečníku pod kontrolou UZ – nezralé • T-lymfocyty •plodová voda – z amniového vaku pod kontrolou UZ - kožní • fibroblasty - amniocyty •choriové klky – z chorionu nebo placenty pod kontrolou UZ – buňky • choriových klků •kůže – z potracených plodů, kožní biopsie pacientů – kožní • fibroblasty •kostní dřeň – z prsní kosti, lopaty kosti kyčelní – prekurzory krevních buněk •solidní tumory – z nádoru – maligní buňky • • • • • Pro nasazení do kultivačního média neizolujeme jen určitý typ buněk, ale nasazujeme plný materiál se všemi typy buněk. [USEMAP] KULTIVACE MATERIÁLU [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nasazení do kultivačního média •Sterilní práce v laminárním boxu nádory2 001 !!!!!!!STERILNÍ PROSTŘEDÍ!!!!!!! [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu inverzní mikroskop 2 nasazení plodové vody nasazení periferní krve aplikace kolchicinu – mitotického jedu – po kultivaci kultivace v termostatu 1 2 3 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace T-lymfocytů z periferní krve •kultivace periferní krve v médiu • s přídavkem mitogenu phytohemaglutininu (PHA) • = látka izolovaná z fazolu obecného (Phaseolus vulgaris) • - T-lymfocyty = zralé diferencované buňky s malou spontánní mitotickou aktivitou • - vlivem PHA se dediferencují (přeměna na nezralé buňky lymfoblasty, které se dělí (tzn. vstupují do mitózy!) • (např. k nezralým buňkám – blastům z kostní dřeně • onkologických pacientů není třeba PHA přidávat, • dělí se samovolně) • - význam kultivace – spiralizace chromosomů během procesu mitózy • - složení kultivačního média – živné látky, antibiotikum, PHA, • stabilizátor pH • • • • fazole [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •aplikace kolchicinu (alkaloid z ocúnu jesenního Colchicum autumnale) • - zastavení dělení buněk v metafázi mitózy • - kolchicin je mitotický jed, který specificky • inhibuje tvorbu dělícího vřeténka a tím zastavuje • dělení buněk v metafázi mitózy, kdy • jsou chromosomy vhodné k analýze ocún [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY kultivace materiálu •délka kultivace • - periferní krev – 72 hodin (stanovení karyotypu) • - 48 hodin (stanovení % aberantních buněk) • kratší doba kultivace - podmínkou je zachytit • 1. buněčné dělení, později dochází ke spontánní • opravě zlomů na chromosomech nebo k zániku • buněk s aberací • - krev plodu 72 hodin (stanovení karyotypu) • - plodová voda – průměrně 10 dní (stanovení karyotypu) • - choriové klky – kultivace průměrně 10 dní • - kůže – variabilní doba růstu (průměrně 2 týdny) • [USEMAP] ZPRACOVÁNÍ SUSPENZE BUNĚK [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •hypotonizace • lýza erytrocytů, zvětšení objemu T – lymfocytů (buňky nezlyzují!), rozestoupení chromosomů v důsledku působení hypotonického roztoku fotky 040 fotky 044 přídavek roztoku KCl (periferní krev) inkubace hypotonizační směsi v termostatu 37°C [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze •fixace – získání suspenze • - kyselina octová (1) : metanol (3) • - zviditelnění struktury a zlepšení barvitelnosti chromosomů, rozrušení • cytoplasmy buněk, rozpuštění nečistot • • fotky 190 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY zpracování suspenze – rekapitulace kroků • • • k bodu 28 1- vzorek po kultivaci a centrifugaci 2 – po hypotonizaci a centrifugaci 3 – po fixaci a centrifugaci (přídavek fixativu 3x) 4 – výsledná suspenze buněk 1 2 3 3 3 4 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY • vykapání suspenze na podložní sklíčka (na sklíčcích jsou rozloženy buňky s chromosomy a interfázní jádra, sklíčko samovolně zasychá ve vodorovné poloze na laboratorním stole) přednáška 090 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY G - pruhování chromosomů G - pruhování chromosomů přednáška 022 2 – barvení barvivem Giemsa – Romanowski - A přednáška 065 A 1 - inkubace preparátu v roztoku enzymu trypsinu (natrávení proteinů na povrchu chromosomů) 12-8 chromosom s G-pruhy [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY nebo konvenční barvení chromosomů konvenční barvení chromosomů barvení barvivem Giemsa – Romanowski - A přednáška 065 A zlomy1 chromosom konvenčně barvený (vynechán krok natrávení chromosomových proteinů trypsinem) [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení • chromosomy hodnotíme ve světelném mikroskopu •zdroj světla - viditelná část spektra (halogenová žárovka) • kongo4 přednáška 038 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY barvení / pruhování chromosomů •barvení Giemsovým barvivem (bez inkubace v roztoku trypsinu, obarvuje chromosomy po celé délce, bez pruhů) - hodnocení získaných chr. aberací, které vznikly v důsledku působení mutagenních faktorů prostředí • • •pruhování chromosomů • (hodnocení konstitučního • karyotypu, karyotypu maligních klonů) • • • chromosomy s G - pruhy chromosomy barvené konvenčně C:\Users\3750\Desktop\mitózy\m.jpg [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu • •zvětšení 100 - 200x • vyhledávání mitóz • zvětšení 1000 - 1250x hodnocení dlouhý2 sklíčko2 [USEMAP] přednáška 059 METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu •světelný •mikroskop •s CCD kamerou •napojený •na počítač přednáška 054 přednáška 056 -ve světelném mikroskopu -pomocí počítačové analýzy obrazu [USEMAP] CHROMOSOMY V PRAXI normální mužský karyotyp 46,XY norm mužský [USEMAP] CHROMOSOMY V PRAXI normální ženský karyotyp 46,XX norm [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY hodnocení karyotypu 1)Při vyšetření karyotypu analyzujeme u každého pacienta určitý počet mitóz • s chromosomy s G-pruhy (10, 30, závisí na typu materiálu a jiných • okolnostech, např. stanovení % zastoupení buněčných linií u mozaiek) – • klasická cytogenetika. • •2) a) V případě patologického nálezu na chromosomech s G-pruhy potvrzujeme • a upřesňujeme patologii pomocí metod molekulární cytogenetiky: • - upřesnění % zastoupení buněčných linií u početních aberací • v mozaice (vyšetření 200 interfázních jader – metoda FISH) • - potvrzení a upřesnění nálezu strukturních chromosomových • aberací: - metoda FISH (vyšetření chromosomů v mitózách) • - metody array-CGH, MLPA (pracují s izolovanou DNA pacienta) • b) Pokud je u pacienta přítomna malá strukturní chromosomová aberace, jejíž • velikost je pod hranicí rozlišovací schopnosti metody G-pruhování • chromosomů, pak vyšetření metodou G – pruhování chromosomů bude bez • patologie, ale patologie může být odhalena až metodami s vyšší rozlišovací • schopností (FISH, MLPA, array-CGH). [USEMAP] •důležité odlišnosti mezi přípravou preparátů z periferní krve pro: • 1.stanovení karyotypu – chromosomy s G – pruhy • - délka kultivace 72 hodin • - G-pruhování = inkubace v trypsinu + směs barviv Giemsa – • Romanowski • - nalezenou aberaci se snažíme co nejpřesněji definovat • (i za pomoci metod molekulární cytogenetiky) • •2. stanovení % aberantních buněk – chromosomy konvenčně barvené • - délka kultivace 48 hodin (je třeba zachytit 1. buněčné dělení – • později dochází k opravě zlomů na chromosomech nebo k zániku • buněk s aberací) • - konvenční barvení = pouze Giemsa – Romanowski bez trypsinu • - nalezené aberace podrobně neupřesňujeme, důležité je pouze jestli • je/není v dané buňce některá přítomna VROZENÉ ABNORMALITY / ZÍSKANÉ ABERACE (mutagenní faktory) zlomy1 12-8 [USEMAP] METODY KLASICKÉ CYTOGENETIKY význam pruhování chromosomů •46,XX,t(1;15)(q12;q22) Habánová • rozeznáme chromosomy podobné morfologie (specifické pruhy každý chromosomový pár) • lze zkontrolovat genetický materiál chromosomu po celé délce v rámci rozlišovací schopnosti metody • zápis strukturních přestaveb – v zápisu strukturní přestavby jsou uvedena čísla pruhů na ramenech chromosomů, které vstoupily do přestavby, ve kterých došlo ke zlomu. definován rozsah a lokalizace abnormality [USEMAP] •Kontakt pro dotazy: Navarikova.Marta@fnbrno.cz