Katedra laboratorních metod Laboratorní diagnostika ve
LF MU zdravotnictví
Klinická biochemie cvičení
- 1 Praktické
cvičení datum________________ jméno__________________
Téma praktika:
Stanovení katalytické aktivity enzymů, kinetické měření I.
Okruhy k nastudování a dotazy:
1) Seznamte se s postupem uvedeným v protokolu.
2) Při jakých teplotách se v současnosti v klinické biochemii enzymatické měření
provádí?
3) Do protokolu načrtněte graf závislosti absorbance na koncentraci pro laktát
dehydrogenázu (LD) stanovovanou uvedeným principem (malý obrázek).
4) Na automatickém analyzátoru budete stanovovat také alaninaminotransferázu (ALT) –
seznamte se s běžně užívaným principem stanovení a dle toho načrtněte graf závislosti
absorbance na koncentraci (při vlnové délce 340 nm).
Přístroje a pomůcky:
Fotometr Lambda 20
Automatický biochemický analyzátor Cobas Integra 400 Plus
Termoblok Evaterm
Automatické pipety + spotřební materiál
Reagenční set LDH – Lactate dehydrogenase liquid acc. to IFCC (Roche)
Úkoly:
1) Provést manuální stanovení LD dle následujícího návodu
Princip:
L-laktát + NAD+
<____LD____
> pyruvát + NADH + H+
Katalytická aktivita LD je úměrná nárůstu absorbance při 340 nm.
Složení setu :
Činidlo1: N-metylglukamin, laktát litný, stabilizátory
Činidlo 2: NAD+
(koenzym)
Roztoky jsou připraveny k přímému použití.
Referenční interval LD: Novorozenci do 20 dní 3,75 - 10,00 µkat/l
Děti 20 dní – 15 let 2,00 - 5,00 µkat/l
Muži 2,25 - 3,75 ukat/l
Ženy 2,25 - 3,55 ukat/l
Katedra laboratorních metod Laboratorní diagnostika ve
LF MU zdravotnictví
Klinická biochemie cvičení
- 2 Pracovní
postup:
odměřit v ml vzorek kalibrátor
činidlo 1
sérum
kalibrátor
2.00
0.100
-
2.00
-
0.100
promíchat, inkubace 5 minut při 37°C, na tento roztok spektrofotometr vynulovat
činidlo 2 0.400 0.400
promíchat, inkubace 1 minuta,
nalít do kyvety, měřit absorbance ve stanovených časových intervalech
a) Změřte katalytickou aktivitu LD pro kalibrátor, a dva vzorky. Proveďte časové
měření po 60s v časovém intervalu 4 minut
Kal. A A Vz.1 A A Vz.2 A A
měření po smíchání
měření za 1 minutu
měření za 2 minutu
měření za 3 minutu
měření za 4 minuty
b) Z naměřených dat vypočtěte katalytickou aktivitu LD v neznámých vzorcích
c) Hodnoty pro kalibrátor zpracujte graficky jako závislost
absorbance na čase
Katedra laboratorních metod Laboratorní diagnostika ve
LF MU zdravotnictví
Klinická biochemie cvičení
- 3 -
2) Na automatickém biochemickém analyzátoru změřte katalytickou aktivitu ALT,
AST, CK a LD u tří připravených vzorků (jedná se o vzorky s vysokými
hodnotami):
a) Důkladně se seznamte s grafickým zpracováním průběhu reakce (vyčerpání
substrátu) a vyznačením rozmezí bodů, ve kterých probíhá měření
b) Dle potřeby proveďte rerun vzorků – různé možnosti automatického ředění,
které provádí analyzátor a také ruční ředění. Výsledky včetně násobku ředění a
chybových hlášení zapište do tabulky:
Závěr:__________________________________________________________________
________________________________________________________________________
Č.vzorku/ukat/l AST ALT CK LD
1
2
3