Laboratorní diagnostika návykových látek Mgr. Zuzana Strašilová Za jakým účelem se stanovují návykové látky? -v rámci policejních kontrol - -k odlišení symptomů nebo k ujištění, že pacient není pod jejich vlivem před některými lékařskými zákroky - -sledování dodržování léčby -u těhotných žen, které mají v anamnéze dřívější užívání drog (užitečné pro následnou péči o novorozence) - -někteří zaměstnavatelé vyžadují drogový screening jako součást vstupních nebo preventivních prohlídek ( zejména u osob, které při výkonu svého povolání mohou ohrozit zdraví a životy ostatních lidí – řidiči MHD, zdravotnický personál apod.) Stanovení na několika úrovních: •Orientační (vhodné i pro terénní účely) •Semikvantitativní (drogový screening v klinických laboratořích) •Konfirmační (analýza ve specializovaných toxikologických laboratořích) Orientační testy - -patří do kategorie testů POCT (rychlá analýza v terénu, u lůžka apod.) -materiál: sliny, moč, krev, pot, pevné látky (ubrousky na kokain) - -možná detekce několika druhů drog v rámci jednoho testu -nižší spolehlivost (95 %), možná falešná pozitivita či falešná negativita (v dané skupině nemusí reagovat všechny strukturní deriváty) - -nemohou samy o sobě odlišit nelegální užívané drogy od komponent stejné třídy, které mohou být obsaženy v předepisovaných lécích (FP) V případě pozitivního výsledku orientačního testu je třeba zajistit materiál a zaslat ho k vyšetření ve specializované toxikologické laboratoři, která k takové analýze má oprávnění! Princip stanovení Schéma uspořádání membrán v LFIA testu (nárys a půdorys); a – podložka pro vzorek, b – podložka pro konjugát, c – membrána s testovací a kontrolní linkou v detekční zóně, d – absorpční podložka, e – plastová výztuž membrány Ukázka membránového testu v kazetě; a – uspořádání membrán v kazetě, b – výsledek testu standardního roztoku bez analytu a s vysokou koncentrací analytu (www.chemickelisty.cz) Drogový screening pomocí testovacích kazet Metoda LFIA •Kompetice drogy ve vzorku se značeným konjugátem drogy imobilizovaným na membráně o vazbu na specifickou protilátku imobilizovanou v testovací a kontrolní zóně testu 6 Kazetový test Jiný příklad: Kazetový test Syva®RapidTest (pozitivní na amfetaminy) 7 Metody stanovení •1. Chromatografické metody • HPLC • HPLC/MS • LC/MS • GC/MS • TLC 8 •2. Imunoanalytické metody • a) fluorescenční imunoanalýza • (FIA, FPIA, DELFIA) • b) enzymová imunoanalýza • (EMIT, ELISA, MEIA,CEDIA) • c) luminiscenční imunoanalýza • (LIA, ILMA, CMIA, ECLIA,… • • Drogový screening v klinické laboratoři Imunochemická vyšetření -semikvantitativní stanovení (výsledek je pouze orientační, vyžaduje potvrzení a upřesnění více specifickou nezávislou metodou) - -screeningové metody mohou sloužit pro zaměření na další analytické postupy – vstupní náhled na soubor látek - -uvážení možností imunochemických metod a správná interpretace výsledků slouží k rychlému řešení akutních intoxikací - -materiál: jednorázová moč - nevyžadují izolaci a zakoncentrování analytu vysoká citlivost vysoká rychlost jednoduchost, nenáročnost na kvalifikaci vhodné pro automatizaci vhodné pro sériová vyšetření Kinetická interakce mikročástic v roztoku - KIMS •protilátka proti příslušnému analytu v moči je kovalentně vázána na mikročástice a derivát analytu je připojen k makromolekule • •kinetická interakce mikročástic v roztoku je vyvolána vazbou konjugátu analytu na protilátku na mikročástici a je měřena jako změna průchodu světla. •mezi konjugátem a nekonjugovaným analytem ve vzorku probíhá kompetitivní reakce o vazebná místa protilátky proti analytu navázané na mikročástice • •přítomnost analytu ve vzorku úměrně snižuje nárůst absorbance vůči koncentraci drogy ve vzorku www.drugdetection.net Plynová chromatografie s hmotnostní detekcí (GC-MS) -velká specifita hmotnostních spekter - jsou standardem pro identifikaci neznámých látek v toxikologii - -reprodukovatelné retenční parametry, mezilaboratorní přenos retenčních dat, databáze retenčních indexů - -velká separační účinnost GC kapilár - -použití: chemická identifikace širokého spektra neznámých látek potvrzovací analýzy užší skupiny látek kvantifikace – stanovení známé látky GC-MS: potvrzení přítomnosti heroinu http://soudni.lf1.cuni.cz/ GC-MS: intoxikace kokainem a extází http://soudni.lf1.cuni.cz/ Tenkovrstevná chromatografie (TLC) - -využívá princip dělení směsi látek mezi stacionární a mobilní fázi - využívá adsorpční a rozdělovací chromatografii - -využívá princip extrakčního chování nox – dělení na látky bazické, kyselé a neutrální - -denzitometrická kvantifikace (UV, VIS) - -jednoduché a rychlé provedení - -při dobré volbě extrakce a detekčních činidel poskytuje velmi dobré kvalitativní rozlišení neznámé látky - - Tenkovrstevná chromatografie (TLC) - -způsob provedení: Stacionární fáze – silikagel (kyselina křemičitá), oxid hlinitý, komerční přípravky: silufol, kieselgel G Mobilní fáze – směs organických rozpouštědel - -RF faktor – podíl vzdálenosti středu skvrny látky od startu a vzdálenosti čela rozpouštědla - -RF faktor ovlivňuje: chemická struktura látky složení mobilní fáze pH teplota, vlhkost materiál nosiče - Repetitorium chemie IX (2016) (teorie a praxe chromatografie) - PDF Stažení zdarma Tenkovrstevná chromatografie (TLC) EMIT (Enzyme-multiplied immunoassay technique) -Homogenní kompetitivní imunoanalýza - -kompetice mezi látkou ve vzorku a látkou značenou enzymem o vazebná místa na protilátce. - -Enzym = glukoso-6-fosfát dehydrogenáza (G6PDH) -aktivní enzym mění NAD na NADH → změna absorbance - -aktivita enzymu klesá při vazbě protilátky, proto lze koncentraci látky ve vzorku měřit podle změny aktivity enzymu. - - Př. Kotinin v moči (DRI Cotinine Assay, ThermoScientific/ cobas c8000, Roche) - Referenční meze kotininu v moči <30 (nekuřáci) 50-500 (vystavení nikotinu – lehký/pasivní kuřák) >500 (abúzus tabákových výrobků) Vzorek č. Udaná expozice Výsledky [ng/ml] 1 do 5 cigaret denně 389 2 10-15 denně 2009 3 10-15 denně 971 4 15-20 denně 1304 5 20-25 denně 1848 6 25-30 denně 1517 7 15-20 denně 2142 8 10-15 denně 615 9 10-15 denně 589 10 10 denně 1746 11 nekuřák 0 12 příležitostně 0 13 nekuřák 0 15 nekuřák 3 16 nekuřák 0 Konfirmační analýza návykových látek - -základní princip toxikologie: potvrzování výsledků navzájem nezávislými metodami - -klinický a forenzně toxikologický standard současnosti: metody hmotnostní spektrometrie v tandemu s plynovou nebo kapalinovou chromatografií GC-MS, LC-MS - bezpečná identifikaci neznámé látky a přesné stanovení její koncentrace - -výsledky takového konfirmačního vyšetřování je jako jediné možné použít i pro soudně-lékařské účely (tedy pouze laboratoře forenzní toxikologie, soudní toxikologie) http://www.soudnilekarstvi.cz/wp-content/uploads/2014/10/Seznam-laboratoří-kvalifikovaných-pro-vyše třování-specifikovaných-návykových-látek.pdf - -materiál: moč, krev, sliny, pot, vlasy, žaludeční obsah, tkáně, podezřelé látky Další toxikologická vyšetření v klinické laboratoři • •Deriváty Hb (COHb, MetHb, SulfHb, CNHb) - přímá spektrofotometrie - analyzátory ABR s fotometrickým systémem, paralelní stanovení Hb, oxyHb • •Ethanol, Methanol, Ethylenglykol – osmolární okno • •TDM (Therapeutic Drug Monitoring) – imunoanalýza, HPLC, LC-MS • •Li, Pb - AAS • Etanol • akutní: excitační a narkotický účinek na CNS, metabolická acidóza, hypoglykémie, hyperurikémie, ↑ ALT, ↑ osmolalita • •chronický účinek: steatóza až cirhóza jater, ↑GMT, ↑%CDT • •> 3‰ : kóma, křeče, hypotermie (podchlazení), hrozí smrt vyvolána útlumem dechového centra a oběhovým selháním • •u alkoholika nebo osoby dlouhodobě nadužívající alkohol vzniká jakási "rezistence" ( odolnost) a tyto stavy mohou nastoupit až ve vyšším stupni opilosti ) • Otrava alkoholy Metanol •Nejdříve příznaky podobné ethanolu (lehká opilost, horší artikulace) poté 12 – 24 hod. bez příznaků (s kombinaci s alkoholem až 36 hod.) , následuje bolet hlavy, dušnost, bolest břicha , křeče, snížená ostrost vidění, rozvrat met. procesů • • toxické účinky met. produktů – formaldehydu (na zrakový nerv), kys. mravenčí (met. acidóza) • •tox. dávka – 0,1 ml/ kg, smrtelná dávka – 1 ml/kg • •Léčba: podání antidota (etanol, fomepizol) min. tvorbu tox. produktů (kompetitivní inhibice alkoholdehydrogenázy); HD – odstraňuje metanol i jeho metabolity, koriguje metalické poruchy • Otrava alkoholy Ethylenglykol •metabolizován v játrech působením alkohol - a aldehyd-dehydrogenázy na silné kyseliny (glyoxalovou, šťavelovou, oxalovou), • •vzniká těžká metabolická acidóza, která se prudce zhoršuje a ohrožuje život otráveného • •kys. oxalová se váže s Ca, depozita krystalů šťavelanu vápenatého vedou k poškození buněk (mozek, ledviny, myokard, plíce), také výrazné ↑↑ osmolality • •tox. dávka 200 mg/l, smrtelná dávka: 850- 2000 mg/l (nejednotné údaje) Otrava alkoholy Ethylenglykol •Příznaky otravy: opilost bez zápachu alkoholu • •Neurologické stádium (30 min. – 12 h. po požití) opilost, euforie, smazaná řeč, ospalost, zvracení. Během 4-12 h. rozvoj met. acidózy • •Kardiopulmonální stádium (12-24 h.) – tachykardie, hypo nebo hypertenze, težká m. acidóza a s hyperventylací a selháváním orgánů • •Renální stádium – (24 -72 h.) – hematurie, albuminurie, selhání ledvin, ne vždy úprave fce ledvin • •Léčba: podání etanolu (100x vyšší afinita k ADH); HD – odstraní ET i metabolity, upraví acidózu Otrava alkoholy