Cystická fibróza Cystická fibróza I/ Klinické podezření 1. Chronické sinobronchiální onemocnění • recidivující pneumonie a infekty dolních cest dýchacích (DCD), • perzistující kolonizace • infekce DCD patogeny typickými pro CF: Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, • chronický produktivní kašel, pískoty, • Paličkovité prsty • typické radiologické změny na skiagramu hrudníku a/nebo HRCT plic, • přítomnost obstrukční ventilační poruchy jinak nevysvětlitelné. 2. Gastrointestinální onemocnění • Postižení pankreatu (zevní insuficience pankreatu, recidivující pankreatitidy), • postižení střeva (mekoniový ileus, syndrom distální střevní obstrukce, prolaps rekta), • chronické hepatobiliární onemocnění. 3. Malnutrice • hubnutí, • porucha růstu • steatorrhea, • avitaminóza vitaminů rozpustných v tucích • osteopenie, • osteporóza • hypoproteinemické otoky. 4. Obstruktivní azoospermie. 5. Syndrom ztráty solí • akutní ztráta solí s hypovolemickým šokem • chronická metabolická alkalóza. Cystická fibróza II/Laboratorní vyšetření – jsou nedílnou součástí diagnostiky CF. V současné době jsou používány metody: 1. Potní test – stimulujeme pocení pilokarpinovou iontoforézou a v potu vyšetřujeme koncentraci chloridů. Normální koncentrace chloridů v potu je 10–30 mmol/l, Hraniční hodnoty jsou 30–60 mmol/l. Při výsledku nad 60 mmol/l je vyšetření pozitivní. 2. Molekulárně genetické vyšetření Vyšetření je pozitivní při nálezu mutace obou alel genu CFTR. Geneticky by měli být vyšetřeni i rodiče, sourozenci a pokrevní příbuzní CF pacientů. Genetické vyšetření můžeme použít i v rámci prenatální a preimplantační diagnostiky. Cystická fibróza Molekulární podstata choroby chloridový kanál regulující transport iontů přes buněčnou membránu lokalizovaný v apikální membráně epiteliálních buněk Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR Strukturální nebo funkční porucha CFTR způsobuje alteraci transportů solí přes buněčnou membránu dvěma možnými způsoby: 1) zvýšenou absorpcí sodíku, který s sebou táhne do buněk vodu a dochází k poklesu množství tekutiny v hlenu, mukostáze a poruše mukociliární clearence, 2) defektem transportu chloridových iontů, jejichž koncentrace v hlenu vzrůstá, hlen přestává být hypotonický, a proto nedochází k aktivaci antimikrobiálních peptidů – defenzinů. Tento proces vede k poškození plicních obranných mechanizmů a rozvoji perzistující infekce a zánětu. Defektní CFTR mimo toho dysreguluje cytokinovou síť a alteruje sekreční funkci podslizničních žlázových buněk a tím také mění viskozitu a vlastnosti hlenu. Protizánětlivá aktivita je neadekvátní díky nedostatečné produkci protizánětlivých cytokinů a snížené činnosti antiproteáz a antioxidačního systému. Zánět je u CF primárně způsoben defektním CFTR a infekce přistupuje až sekundárně a celý proces tkáňového postižení stupňuje a urychluje. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR •Tvořen 5ti doménami: 2 membrane spanning domains 2 nucleotide binding domains 1 regulatory domain Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator CFTR klidové stádium aktivní stádium hydrolysis Vyžaduje: • cyclic AMP •protein kinase A •ATP CFTR exprese ve všech tkáních (vyjma nervové) multiorgánové onemocnění CF plíce CF pancreas CF potní žlázy CF reprodukční trakt Muži Asi 98 % dospělých CF mužů je infertilních, nikoliv sterilních. Příčinou je prenatální obstrukce vasis deferentis (CBAVD) se slepým zakončením nadvarlete. Obstruktivní azoospermie může být zcela izolovaným příznakem Ženy U žen se může v děložním hrdle tvořit vazký hlen, který může způsobovat obtíže při oplodnění. Častá primární nebo sekundární amenorrhea v důsledku poruch výživy a plicních změn 1989 Lap-Chee Tsui, centre, with Francis Collins and John Riordan, on that special day in 1989 Lap-Chee Tsui,, John Riordan, Francis S. Collins, Johanna Rommens Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) gene objeven, klonován, lokalizován a sekvenován září 1989 článek o klonování CFTR genu s 4 letým Danny Bessettem, dítětem s CF (Photo: Steve Barrett/Science) Danny Bessette po 20 letech •lokalizován na chromozomu 7 (7q31) •250 kb dlouhý •27 exonů •cDNA sekvence dlouhá 6129 bp kóduje 1480 aminokyselin CFTR proteinu Gen CFTR Gen CFTR •lokalizován na chromozomu 7 (7q31) •250 kb dlouhý •27 exonů •cDNA sekvence dlouhá 6129 bp kóduje 1480 aminokyselin CFTR proteinu 1989 CF mutace F508del CFTR gen 1932 mutací Cystic Fibrosis Mutation Database. http://www.genet.sickkids.on.ca/StatisticsPage.html CFTR gen 2000 mutací Cystic Fibrosis Mutation Database. http://www.genet.sickkids.on.ca/StatisticsPage.html • většina z nich je raritní, „privátní“ nebo jejich vztah k CF nebyl prokázán • pouze 7 mutací vyskytuje na více než 1% CF patologických alel • je pozorováno široké rozpětí ve frekvenci jednotlivých mutací u různých populací • nejčastější mutatace F508del je detekována u cca 66% CF pacientů Třídy mutací CFTR Normalní CFTR Nucleus chromosome 7 Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein – postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein – umístěn v buněčné membráně CF mutace: třída I Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane chromosome 7 •CFTR gen – stop kodón zkrácená , nefunkční messenger RNA Třídy mutací CFTR Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein – selhání maturace mutace F508del dává CFTR nesprávný tvar degradován proteolýzou CF mutace: třída II chromosome 7 Třídy mutací CFTR Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein – postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein – umístěn v buněčné membráně •CFTR protein není aktivní mutace G551D – nefukční NBD1 doména CF mutace: třída III Třídy mutací CFTR chromosome 7 Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane •CFTR gen - přepsán (transkribce) do messenger RNA • mRNA CFTR - přeložena (translace) do proteinu •CFTR protein – postranslační modifikace (glycosylace) •CFTR maturovaný protein – umístěn v buněčné membráně • maturovaný CFTR protein je defektní mutace R347P – snižuje chloridovou konduktanci chromosome 7 CF mutace: třída IV Třídy mutací CFTR Nucleus Endoplasmic Reticulum Golgi Apparatus Cell Membrane •CFTR gen – sestřihová mutace část mRNAs defektní snížené množství CFTR proteinu mutace 3849+10kb setřihová (splicing) mutace chromosome 7 CF mutace: třída V Třídy mutací CFTR Třídy mutací CFTR 196 sekvenčních variací v genu CFTR PolyT-TG alelické varianty (Tn) v intronu 8 genu CFTR 3 konfigurace traktu: 9 T- 10/11TG – účinné akceptorové místo sestřihu 7 T- 10/11TG – účinné akceptorové místo sestřihu 5 T-12/13TG – neúčinné akceptorové místo sestřihu chybí exon 9 u 90% syntetizovaného CFTR chybná funkce CFTR 5T alela považována za mutaci asociavanou s širokým spektrem příznaků Žena: zdravá atypická CF typická CF Muž: CBVAD atypická CF typickáCF Sekvenční varianty CFTR 196 sekvenčních variací v genu CFTR PolyT-TG alelické varianty (Tn) v intronu 8 genu CFTR Sekvenční varianty CFTR Kongenitální bilaterální absence vas deferns (CBVAD) popsáno 25 mutací asociovaných s CBVAD v exonech missense v intronech mRNA splicing defekt Frekvenkventované CBVAD mutace: • 5T vatianta v intrv IVS8 • R117H • 10,11,12 TG v IVS8 Molekulární diagnostika cystické fibrózy Mutační analýza CFTR genu Scoring nejčastějších mutací • Amplifikace úseku s předpokládanou delecí • PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNA • SSCP s pozitivními kontrolami • analýza teploty tání s pozitivními kontrolami • PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNAi • hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy • PCR s alelově specifickými primery (ARMS test) Scanning raritních mutací • jednořetězcový konformační polymorfismus (SSCP) • denaturační gradientová elektroforéza • analýza teploty tání • sekvenování • next generation sequencing Přímá dg. Nepřímá dg. Vazebná analýza pomocí STR Analýza exprese IVS8 poly T-TG Amplifikace úseku s předpokládanou delecí CF mutace F508del 1. Marker 2. [F508del];[F508del] 3. [F508del];[=] 4. wt 5. [F508del];[=] delece tří nukleotidů CTT v CF exonu 10 ztráta jedné aminokyseliny – fenylalaninu v pozici 508 v CFTR proteinu PCR s primery ohraničujícími předpokládané místo delece úspěšná amplifikace odhalí místo specifické přestavby v DNA 1 2 3 1. [CFTRdele2,3(21kb)];[=] 2. wt 3. wt ELFO: 5% PAGE, 200 V, 20°C, 2hours Polyacrylamidová gelová elektroforéza duplex PCR produktu: 1. Primery 2,3F a 2,3R -ohraničují deleční bod zlomu amplifikace 207bp dlouhého produktu přítomnost delece 2. Kontrolní primery 3i-5 a 3i-3 amplifikace 309bp dlouhého produktu obsahujícího exon 3 nepřítomnost delece Duplex PCR zajišťuje interní amplifikační kontrolu a umožňuje rozlišit mezi homozygtem a heterozygotem pro deleci Jednořetězcový konformační polymorfismus SSCP technika založená na elektroforetické mobilitě jednořetězců DNA. Cílový produkt amplifikace DNA je teplotně denaturován na jednořetězce a je podroben elektroforéze. Za nedenaturujících podmínek zaujímá ssDNA sekundární strukturu podmíněnou sekvencí nukleotidů. Přítomnost mutace tuto strukturu mění, tím je ovlivněna i rychlost migrace DNA a na gelu nebo v kapiláře můžeme detekovat nadbytečný proužek nebo pík. Jednořetězcový konformační polymorfismus SSCP R553X G551D G542X ELFO: 8% PAGE,200 V, 20°C, 2hours Test založený na analýze bodu tání fluorescenčně značených prob po vysokorychlostní PCR na přístroji LightCycler Test založený na analýze bodu tání fluorescenčně značených prob po vysokorychlostní PCR na Real-Time PCR Pro detekci produktu v průběhu PCR existují následující metody: Na DNA se vázající interkalační barviva SYBR green I Na menší žlábek dsDNA se vázající barviva BEBO Technologie využívající fluorescenční výměny dvakrát fluorescenčně značené sondy vázající se na střední část amplifikovaného produktu TaqMan Molekulární majáky QZyme jedenkrát fluorescenčně značené sondy nebo primery FRET LUX PNA dvakrát fluorescenčně značené primery AmpliFluor Scorpions Detekce mutace F508del PCR: jeden pár primerů Analýza bodu tání: jeden systém prob F508delaccording to Burgraf, 2001 Fluorescenční monitoring dF508 lokusu 1 2 3 4 5 6 5 wt wt wt wt dF508/nondF508 K-DNA 1 2 3 4 5 6 Detekce mutací G542X, G551D a R553X PCR: jeden pár primerů Analýza bodu tání: dva systémy prob G542X G551D, R553X according to Burgraf, 2001 6 5 1 3 4 2 5 5 6 1,2,3,4 wt wt R553X/non G551D/non G542X/non K-DNA 1 2 3 4 5 6 Fluorescenční monitoring G542X lokusu Fluorescenční monitoring G551D/R553X lokusu Primer Position: 37 889 deletion2,3(21kb) Primer Position: 59 154 Primer Position: 37 889 breakpoint Primer Position: 38 200 LC Red705 Detekce mutace CFTRdele2,3(21kb) PCR: jeden F primer dva specifické R primery Analýza bodu tání: dva systémy prob Alela bez delece - wt Alela s delecí - mt wt wt CFTRdele2,3(21kb)/non wt wt K-DNA 1 2 3 4 5 6 3 1,2,,4,5,6 6 5 4 3 2 1 Fluorescenční analýza lokusu bez delece Fluorescenční analýza lokusu s delecí LiPA CFTR19 and INNO-LiPA CFTR17+Tn LiPA CFTR19 and INNO-LiPA CFTR17+Tn Metoda fluorescenční multiplex ARMS (amplification refractory mutation system) Princip: Mismatch PCR primeru na 3´konci znemožňuje PCR •Metodické prevedení: –3 primery: •1 spec. pro normální alelu(N) –forwardprimer •1 spec. pro mutovanou alelu(M) –forwardprimer •1 společný (S) -reverse primer •plus pár primerů pro kontrolní PCR reakci –2 PCR reakce: NN NM MM •1. PCR S-N + + •2. PCR S-M - + + Metoda fluorescenční multiplex ARMS (amplification refractory mutation system) Metoda fluorescenční multiplex ARMS (amplification refractory mutation system) Elucigene CF-EU Detekované mutace CFTRdele 2,3 E60X P67L G85E R117H 621+1G>T 711+1G>T 1078delT R334W R347P A455E l507del F508del 1717-1G>A G542X S549RT>G G551D R553X R560T 1898+1G>A 2184delA 2789+5G>A 3120+1G>A M1101K D1152H R1162X 3659delC 3849+10kbC>T S1251N 3905insT W1282X N1303K Elucigene CF-EU Metoda fluorescenční multiplex ARMS (amplification refractory mutation system) Akce bude ohodnocena kredity Sekvenování nová missense mutace c.2863T>C, p. S955P. p.[=]+[S955P] p.[F508del]+[S955P] p.[F508del]+[=] p.[=]+[S955P] Nová mutace S159P Názvosloví c.[1521_1523delCTT];[350G>A], p.[Phe508del ];[Arg117His ], legacy name: [deltaF508];[R117H], IVS8 c.[1210-12T(7)];[1210-12T(9)] Novorozenecký screening cystické fibrózy Na cystickou fibrózu jsou od roku 2009 testováni všichni novorozenci: diagnóza v prvních týdnech života totiž znamená příznivější prognózu tohoto onemocnění. Díky novorozeneckému screeningu je možné léčbu včas specificky zaměřit – zejména udržet funkční plíce a co nejlepší výživu do doby, než bude k dispozici genová terapie, která je velkou nadějí pro vyléčení nemoci. Novorozenecký screening cystické fibrózy 1. vyšetření hladiny imunoreaktivního trypsinogenu (IRT) imunoanalytickou metodou, 2. při podezření na CF (vysoké IRT) je druhým krokem molekulárně genetická analýza nejčastějších, jednoznačně patogenních a populačně významných mutací v genu CFTR ze stejných suchých kapek krve na screeningové kartičce, ve kterých byla zjištěna zvýšená koncentrace IRT, 3. při velmi vysokém IRT a neprokázání mutace je třetím krokem provedení potního testu pomocí pilokarpinové iontoforézy metoda odběru tzv. suché kapky krve na novorozenecké screeningové kartičce