Komlexní diagnostika Duchennovy svalové dystrofie http://zdravi.idnes.cz/zdravi_deti.asp?r=zdravi_deti&c=A060213_155355_zdravi_deti_ad Šestiletý Daniel trpí svalovou dystrofií. Je upoután na vozíku a jeho svalstvo postupně ochabuje. Naděje, že se chlapec dožije dospělosti, je velmi malá. Když jde do první třídy, už se velmi špatně hýbe, nemá rovnováhu a hodně padá. Než vyjde z devítky, je trvale invalidní, připoutaný na vozíku. A přijímaček na vysokou se nejspíš vůbec nedožije. Tak to vypadá, když má chlapec Duchennovu svalovou dystrofii. • genetická choroba • tělo nemocného při ní není schopné produkovat svalovou bílkovinu dystrofin • důsledku toho začnou svaly postupně ochabovat: nejprve kosterní, pak dýchací a nakonec i srdce • světově nejrozšířenější forma svalové dystrofie • postihne jednoho ze tří tisíc narozených chlapců • v Česku je evidováno asi pět stovek nemocných Duchennova svalová dystrofie Guillaume Benjamin Amand Duchenne narozen. 17. září 1806, Boulogne, Francie zemřel 15. září 1875, Paříž, Francie • francouzský neurolog • popsal několik nervových a svalových poruch •Aplikoval elektrody,za jejichž pomoci se zjišťoval průběh stahování svalových vláken. •Vyšetřoval všechny hlavní povrchní svaly za použití elektrod •Byl schopen rozlišit normální a nenormální svalovou reakci. Duchennova svalová dystrofie poprvé posána • nápor nemoci se projeví obvykle později (propuká kolem desátého roku života) • progrese je pomalejší • prognózy hůře předvidatelné • u chlapců s tímto typem nemoci sice tělo dokáže dystrofin vyrobit, ale pouze v malém množství a ve špatné kvalitě • vyskytuje se u 1 chlapce z 18 000 narozených • jako první popsal německý genetik Peter Emil Becker v roce 1955 Beckerova svalová dystrofie mírnější verze • první příznaky se projeví mezi 3. – 6. rokem života Duchennova svalová dystrofie průběh nemoci začnou později chodit zvětšené lýtkové svaly - hypertrofie jsou nemotorní často padají nemohou pořádně běhat či chodit do schodů mají potíže při vstávání ze země • ve školním věku většinou chodí po špičkách, protože mají drasticky zkrácené Achillovy šlachy mění se i držení těla, záda se prohýbají, břicho se naopak vysunuje vpřed Duchennova svalová dystrofie Průběh nemoci • do 13. let definitivně přestanou chodit a jsou odkázáni na invalidní vozík • 20. narozeniny už zpravidla neoslaví. všechny aktivity, při kterých musí být zapojeny svaly rukou a nohou a trupu vyžadují pomoc Duchennova svalová dystrofie Průběh nemoci • DMD lokus Xp21 Duchennova svalová dystrofie dědičnost X-recesivní DMD v 99,9% postihuje výlučně chlapce (ve vzácných případech mohou onemocnět děvčata) Duchennova svalová dystrofie dystrofinový gen Jeden z největších známých lidských genů 2,4 Mb •79 exonů •14 kb mRNA transkript Mutace 96% frameshift mutací 60-70% rozsáhlých delecí a duplikací 30% nových mutací 10-20% nových mutací jsou gonodální mozaiky produkt – dystrofin exprese ve skeletálním svalstvu a mozku Duchennova svalová dystrofie Dystrofin •427 kDa •sarkolemární protein společně s jinými proteiny zajišťuje spojení extracelulární matrix a cytoplasmatického cytoskeletonu dystrofin asociovaný proteinový komplex Duchennova svalová dystrofie Dystrofin DMD pacienti dystrofin fakticky chybí BMD pacienti •10-40% normálního množství dystrofinu •produkce částečně funkčního dystrofinu v alternativním množství normální dystrofin dystrofin chybí oblasti chybějícího dystrofinu u heterozygotů Determinace kvantity a distribuce dystrofinu imunohistochemickým barvením svalových biopsií •může potvrdit přítomnost dystrofinopatie •umožňuje diferenciaci mezi DMD a BMD •výsledek nemusí být vždy přesný Pouze identifikace patogenní DMD mutace dává absolutní diagnostickou jistotu Duchennova svalová dystrofie Algoritmus molekulárně genetického vyšetření 1. Detekce delecí DMD exonů v hot spot oblastech dystrofinového genu 2. MLPA 3. Sekvenování kódujících oblastí DMD genu 4. Nepřímá DNA dignostka Duchennova svalová dystrofie Detekce delece DMD exonů Základní molekulárně genetická diagnostika založena na detekci delecí DMD exonů v hot spot oblastech dystrofinového genu DMD hot spot oblasti DMD exony 1 – 22 DMD exony 44 - 54 Prováděna multiplex PCR – amplifikace promotorové oblasti a 18 DMD exonů Duchennova svalová dystrofie Detekce delece DMD exonů 4 sety multiplex PCR Zkumavka 1 Pm 535 pb exon 3 410 pb exon 43 357 pb exon 13 238 pb exon 6 207 pb Zkumavka 2 exon 49 439 pb exon 50 271 pb exon 47 181 pb exon 60 139 pb exon 52 113 pb Zkumavka 3 exon 19 459 pb exon 8 360 pb exon 4 196 pb Zkumavka 4 exon 48 506 pb exon 44 426 pb exon 51 388 pb exon 45 307 pb exon 53 212 pb exon 42 155 pbpotvrzena DMD: delece DMD exonů 45, 47, 48 Pm 3 43 13 6 49 50 47 60 52 19 8 4 48 44 51 45 53 42 Duchennova svalová dystrofie Detekce delece DMD exonů Multiplex PCR neodhalí ženu přenašečku žena přenašečka žena nepřenašečka vždy PRC produkt Duchennova svalová dystrofie MLPA MRC-Holland b.v. MLPA® Multiplex Ligation Probe Amplification Duchennova svalová dystrofie MLPA Poprvé popsána: Schouten JP et al. (2002) -Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. Jun 15;30(12):e57. “Multiplex gene dosage analysis made easy” •detekce aberantních DNA sekvencí jednoduchým provedením na základě PCR reakce •minimum pouze 20 ng DNA •Lze analyzovat degradovanou DNA - extrahovanou z tkání v parafínových bločcích - extrahovanou z tkání ve formalínu - volnou fetální DNA získnou z maternální plasmy •diskriminuje sekvence lišící se pouze v jednom nukleotidu •determinuje metylační status promotrů •detekce známých mutací a SNP Duchennova svalová dystrofie MLPA Přístroje termocykler DNA analyzátor Duchennova svalová dystrofie MLPA MLPA techniky 1. Denaturace 2. Hybridizace 3. Ligace 4. Amplifikace Duchennova svalová dystrofie MLPA SALSA MLPA proby Duchennova svalová dystrofie MLPA Hybridizace 1. MLPA probemix je přidán k denaturované genomické DNA 2. Dvě části každé proby hybridizují k odpovídající sekvenci Duchennova svalová dystrofie MLPA Ligace 3. Proby jsou ligovány termostabilní ligásou Duchennova svalová dystrofie MLPA Amplifikace 4. Pár univerzálních primerů je použit k amplifikaci všech ligovaných prób. Amplifikační produkt každé próby má unikátní délku (130 –480 bp) Duchennova svalová dystrofie MLPA Separace a kvantifikace kapilární elektroforézou Každý pík je amlifikační produkt specifické proby Vzorky jsou porovnávány s kontrolním vzorkem Rozdíl v relativní výšce nebo ploše píku v cílové sekvenci próby Duchennova svalová dystrofie MLPA Salsa MLPA Kit P034/P035 DMD/Becker Detekuje delece a duplikace všech exonů DMD genu DMD muž delece probě odpovídající sekvence se projevuje absencí amplifikačního produktu proby DMD žena přenašečka – heterozygot 30- 35% redukovaná plocha píku amplifikačního produktu příslušné proby Mutace/polymorfismy ležících v místech dosedání prob mohou také způsobit redukci plochy píku – deleci jednoho exonu nutné ověřit jinou metodou Duchennova svalová dystrofie MLPA Kontrola P34 Kontrola P35 DMD delece exonů 3 –7 P35 DMD delece exonů 3 –7 P34 Duchennova svalová dystrofie MLPA Kontrola P34 Kontrola P35 Přenašečka delece exonu 8-41 P34 Přenašečka delece exonu 8-41 P35 Duchennova svalová dystrofie MLPA Byla detekována duplikace DMD exonu 2 dystrofinového genu, c.263+?_347-?dup, g.32948164+?_32948247-?. Tato duplikace porušuje čtecí rámec. http://www.dmd.nl/ tam vlezte do DMD exonic deletions/duplications reading-frame checker 1.9 Příklad zápisu výsledku Metodou fluorescenční in situ hybridizace lze lokalizovat cílové nukleotidové sekvence přímo v buňkách (in situ). Duchennova svalová dystrofie FISH Metoda FISH je založena na schopnosti jednořetězcové DNA sondy vázat komplementární úsek cílové DNA fixované na mikroskopickém skle. Duchennova svalová dystrofie proband sestra matka otec Život s dystrofií se podobá temnému tunelu, kde je lepší nevidět konec. Světýlek naděje na léčbu v něm bliká málo. Ale nyní se z temnoty tunelu ozvývá veselý psí štěkot. Na žádnou z podob svalové dystrofie nebyl zatím nalezen účinný lék………ale!!! Duchennova svalová dystrofie Léčba proband sestra matka otec Mesengioblasty - kmenové buňky získané ze stěn cév krevního oběhu - schopné diferenciace na svalová vlákna a produkce dystrofinu - čtyři z pěti psů se postavili na nohy - transplantované buňky pronikly do svalů v různých částech těla, zapojily se do nich a pomohly k nápravě - v některých svalech až 70% vláken dárcovského původu Giulio Cossa, Nature, listopad 2006 Exon skipping - AON (antisense oligonukleotid) -zabraňuje transkripci poškozených exonů - vzniká zkrácený funkční protein