Molekulární diagnostika hemofílie typu A Iveta Valášková Czar Nicholas II of Russia and his family, photographed c. 1916, showing his wife Alexandra (who was a carrier of hemophilia), his four daughters, and (in the foreground) his son Alexis, perhaps the most famous European royal with hemophilia. Nejproslulejší hemofilik - ruský carevič Nikolaj Hemofílie typu A X – vázaná choroba (Xq28) Incidence 1/5 – 10 000 narozených chlapců Porucha tvorby a funkce faktoru VIII Hemofílie typu A dělení dle tíže defektu FVIII nebo FIX (normální hladina FVIII i FIX = 50-150%) těžká (<1%) spontánní krvácivé projevy do kloubů více než 1x měsíčně do svalů zhruba 2 x ročně středně těžká (1-5%) krvácení do kloubů a svalů i po malých úrazech lehká (5-40%) krvácení při chirurgickém či stomatologickém zákroku, po úrazech Hemofílie typu A X- recesivní dědičnost Hemofílie typu A Hemofílie typu A X- recesivní dědičnost Hemofílie typu A Hemofílie typu A Hemofílie typu A Faktor VIII Účastní se srážecí kaskády Hemofílie typu A Faktor VIII Multidoménový glykoprotein Těžký a lehký řetězec Aktivace trombinem 2332 aa Hemofílie typu A Gen pro Faktor VIII 2332 aa 186 kb 26 exonů (9kb) Mutace: inverze, inzerce, substituce, delece Hemofílie typu A Gen pro Faktor VIII 45% pacientů – inverze v intronu 22 Hemofílie typu A Gen pro Faktor VIII qter cen1 - 22 g e n F 8 23-26 F8A F8B ≈ 500kb hF8A 23-26 cen qter F8A hF8A 23-26 intróny 1 - 22 qter 22-1 23-26 cen i n v e r z e interchromatidová rekombinace mezi F8A a hF8A v intronu 22 jsou sekvence F8A a F8B; 500kb před genem je homologní F8A (hF8A) inverze časti F8 genu Hemofílie typu A Metody: Nepřímá diagnostika IS-PCR MLPA Sekvenování NGS Molekulární diagnostika Nepřímá diagnostika Hemofílie typu A Nepřímá diagnostika Hemofílie typu A 243 251 + 193 251 242 - 190 251 242 - 198 243,243 251,251 - , + 190,193 243,251 251,242 - , - 190,190 243 251 - 190 243 251 + 193 243,251 251,242 -, - 190,198 Legenda STR50 STR49 STR45 STR50 243 251 - 190 neznámá mutace haplotyp v asociaci s neznámou mutací Hemofílie typu A Nepřímá diagnostika Legenda STR13 STR22 RFLP18 STR24 Inverzní PCR IS-PCR (Inverse Shifting PCR) Hemofílie typu A Detekce inverze v intronu 1,22 Hemofílie typu A IS-PCR Metoda IS – PCR vychází z původní metody I – PCR. I - PCR (Inverse Polymerase Chain Reaction) • rychlá metoda umožňující in vitro amplifikaci DNA sekvencí, které se nacházejí kolem oblasti se známou sekvencí (Ochman et al., 1988) • využívá principy klasické PCR s tím rozdílem, že použité primery nejsou orientovány „dovnitř“ jak tomu běžně bývá, ale naopak „ven“ ze známé sekvence • templátem těchto reverzních primerů jsou restrikční fragmenty, které byly znovu ligovány aby tak utvořili kružnice IS-PCR Typická PCR amplifikace využívá oligonukleotidové primery, které hybridizují k protilehlým řetězcům. Primery pak bývají orientovány tak, aby směr jejich prodlužování mířil dovnitř, kde se mezi oběma primery nachází požadovaná sekvence. Jelikož je pak produkt jednoho primeru zároveň templátem pro primer opačný, následuje po opakování cyklů denaturace, nasedání primerů a jejich prodlužování exponenciální namnožení kopií oblasti ohraničené těmito primery. Při takto sestavené PCR jsou však oblasti za těmito primery v podstatě nedostupné, jelikož se množí pouze lineárně. http://2007.igem.org/wiki/index.php/McGill/PCR Hemofílie typu A IS-PCR Metoda IS – PCR vychází z původní metody I – PCR. I-PCR však umožňuje namnožení sousedících oblastí, a to v obou směrech od známé sekvence. Důležitý je výběr restrikčního enzymu tak, aby vznikaly fragmenty požadované délky, které zároveň nebudou mít restrikční místo ve známé části sekvence, kam nasedají navržené primery. Tato metoda byla poprvé použita v roce 1988 pro určení místa začlenění inzerční sekvence v bakterii E. coli (a od té doby našla mnoho využití.) (http://what-when-how.com; upraveno) • úsek DNA, na kterém je černě vyznačená známá sekvence • tato DNA je štěpena restrikčním enzymem (místa štěpení jsou označena šipkami) tak, že jeden z fragmentů obsahuje část známé sekvence a dále sekvenci zájmu. • následně probíhá ligace za takových podmínek, abychom docílili vzniku spojených kružnicových molekul. • dalším krokem je provedení PCR, kde primery nasedají na známou sekvenci a jsou orientovány „od sebe“, jak je naznačeno šipkami. • vzniklé produkty pak tedy obsahují neznámou sekvenci ohraničenou sekvencí známou, na rozdíl od původní situace, kde byla známá sekvence obklopena sekvencí neznámou. Hemofílie typu A IS-PCR Metoda IS – PCR vychází z původní metody I – PCR. (http://what-when-how.com; upraveno). Hemofílie typu A IS-PCR (http://what-when-how.com; upraveno). vychází ze stejné metodiky s tím, že v posledním kroku je namísto klasické PCR použita multiplexní PCR se sadou několika primerů, přičemž využití jednotlivých primerů a následně také délka jednotlivých fragmentů je závislá na tom, zda proběhla ve zkoumané DNA inverze. • v případě inverze v intronu 22 budou mít -fragmenty bez inverze délku 487 bp -fragmenty s inverzí délku 385 bp nebo 333 bp podle typu inverze. • v případě inverze v intronu 1 budou mít - fragmenty bez inverze délku 304 bp - fragmenty s inverzi délku 224 bp. Hemofílie typu A IS-PCR a. reprezentuje celogenomovou DNA, b. která je rozštěpena pomocí restriktázy BclI na kratší fragmenty. c. tyto fragmenty se pak za účasti DNA T4 ligázy vážou ke svým vlastním koncům a jsou cirkularizovány. vzniklé kružnice jsou pak použity jako temptáty pro multiplex PCR. výsledné fragmenty, které se liší délkou podle využití primerů, jsou pak rozděleny elektroforézou. d. na gelu je pak možné zjistit jejich délku. -v případě diagnostiky inverze 22, fragmenty bez inverze délka 487 bp, po využití primerů IU a ID (sloupec 1), fragmenty s inverzi délka 559 bp, díky využití primerů IU a ED (sloupec 2). heterozygotní sestava u ženy přenašečky přítomny oba typy fragmentů (sloupec 3). (http://what-when-how.com; upraveno). Hemofílie typu A IS-PCR 1) štěpení pomocí BclI 2) ligace T4DNA ligázou 3) IS PCR za účasti 4 typů primerů 4) PAGE 5) vyhodnocení 1) Zdravý jedinec 2) Inv22 typ I 3) Přenašečka inv 22 typ I 4) Inv 22 typ II 5) Přenašečka inv 22 typ II MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) Hemofílie typu A Umožňuje hodnocení duplikací a delecí jednotlivých exonů MLPA Hemofílie typu A Porovnání relativního množství produktu vůči kontrole Sekvenování Hemofílie typu A Sekvenování všech 26 exonů + promotorové sekvence Celkem 37 amplikonů Porovnávání výsledků s databazí Sekvenování Hemofílie typu A Hemofílie typu A Sekvenování nové generace („next-generation sequencing“, NGS) Příprava knihovny MASTR (Multiplex Amplification of Specific Targets for Resequencing) Hemofílie typu A Léčba Přibližně 400 000 lidí na světě trpí hemofilií. V Česku se jedná o zhruba 1 000 osob. Základem léčby hemofilie je injekční aplikace koncentrátu srážecího faktoru. jenže 15–20 % z nich si proti nim časem vytvoří protilátky. Proto je třeba vyvíjet stále nová léčiva. S myšlenkou preventivního dodávání srážecích faktorů už od raného dětství přišli jako první švédští lékaři před více než 40 lety. Cílem zde není léčba, ale předcházení krvácení, a proto je léčba podávána i tehdy, když pacient fyzicky nekrvácí. Takové preventivní podávání srážecích faktorů může mít pro hemofilika velký význam. , Plazmatické srážecí faktory • z plazmy dárců (z plazmy derivovaný (pdFVIII, pdFIX) • poprvé použity v roce 1965 Rekombinantní faktory • metodou genového inženýrství (rekombinantní deriváty, rFVIII, rFIX). • poprvé použity v roce 1989 • v průběhu výrobního procesu se v podstatě nesetkají s lidskou bílkovinou (platí zejména pro preparáty tzv. „třetí a vyšší generace“). Oba typy preparátů mají v léčbě hemofilie srovnatelnou účinnost. Rozdíl mezi plazmatickými a rekombinantními přípravky tedy není v účinku při léčbě, ale ve způsobu jejich výroby a ve vlastnostech s tím souvisejících Hemofílie typu A Léčba Přibližně 400 000 lidí na světě trpí hemofilií. V Česku se jedná o zhruba 1 000 osob. Základem léčby hemofilie je injekční aplikace koncentrátu srážecího faktoru. jenže 15–20 % z nich si proti nim časem vytvoří protilátky. Proto je třeba vyvíjet stále nová léčiva. S myšlenkou preventivního dodávání srážecích faktorů už od raného dětství přišli jako první švédští lékaři před více než 40 lety. Cílem zde není léčba, ale předcházení krvácení, a proto je léčba podávána i tehdy, když pacient fyzicky nekrvácí. Takové preventivní podávání srážecích faktorů může mít pro hemofilika velký význam. , Plazmatické srážecí faktory • z plazmy dárců (z plazmy derivovaný (pdFVIII, pdFIX) • poprvé použity v roce 1965 Rekombinantní faktory • Rekombinanty zaručují, že nejsou infikovány žádným z dosud známých virů. • V sedmdesátých a osmdesátých letech 20. století postihla hemofilickou populaci, zejména v USA a západní Evropě, nákaza virem HIV, jímž byly v době neznalosti viru tehdejší krevní deriváty často kontaminovány. U nás, protože se užívaly téměř výhradně zdroje plazmy z tuzemských odběrů, se nakazilo jen 17 hemofiliků. Jiné je to s přenosem hepatitidy, zejména hepatitidy typu C. Případy nákazou prostřednictvím aplikace léčebných derivátů, se vyskytly. Hemofílie Léčba Profylaktická léčba hemofilie Primární profylaxe Dlouhodobá pravidelná profylaktická léčba u středně těžkých a těžkých forem hemofilie U středně těžkých a těžkých forem hemofilie se v rámci léčby často přistupuje k preventivnímu podávání srážecích faktorů i v době, kdy nejsou patrné žádné známky krvácení Důvodem je: • snaha eliminovat jakékoli spontánní krvácení do kloubů, • odvrátit vážné a nevratné poškození pohybového aparátu, • zabránit i do budoucna kloubním změnám a tím i jejich deformitám a nepohyblivosti. Profylaktická léčba je v ČR nabízena všem dětem s těžkými projevy hemofilie. Většinou se jedná o děti s hladinou FVIII pod 1 %, ale někdy mohou častými krváceními trpět i děti s hladinou vyšší. Rozhodující je projev – „fenotyp“, nikoli hladina faktoru daná genetickým postižením, „genotypem“ onemocnění. Podle údajů z registru Českého národního hemofilického programu dostává profylaktickou léčbu zhruba třetina všech dětských hemofiliků v ČR. Dávky srážecího faktoru se většinou aplikují 2× až 3× týdně. Dlouhodobá pravidelná profylaktická léčba se u těžkých hemofiliků v současnosti zahajuje ihned po prvním závažném krvácení a neměla by být zahájena později než ve 2 letech, tedy ještě dříve, než může dojít k vážnějšímu poškození kloubů. Profylaxe sekundární Dočasná k pokrytí rizikových období u méně vážných forem hemofílie U méně vážných forem hemofilie může preventivní léčba trvat v řádu týdnů nebo měsíců. Zahajuje se v případě opakovaného krvácení do některého z kloubů nebo vnitřních orgánů, po operacích a v období neobvyklé fyzické aktivity nebo psychického stresu. Jednorázová profylaxe (jedna injekce) Předpokládá se vznik ojedinělého krvácení – např. před plánovanou velkou fyzickou zátěží a/nebo událostí, která by ke krvácení mohla vést, včetně některých lékařských výkonů, intenzivní rehabilitace a podobně… Hemofílie Léčba • Koncentráty faktoru VIII. • Koncentráty faktoru IX. • Léky proti inhibitorům. • Jiné koagulační produkty. • Směsi koncentrátů VIII a IX. Souhrnně je v těchto soupisech v současnosti zapsáno 31 léčivých přípravků, které jsou ve vývoji nebo před uvedením na trh. I kdyby nebyly všechny dány do praxe, je jejich vývoj nadějí pro budoucnost hemofiliků a jejich rodin. Kam vývoj směřuje? Produkty s prodlouženým poločasem. Tzv. prodlužování poločasu přípravků je největším pokrokem v léčbě hemofilie od zavedení virologicky bezpečných koncentrátů v 80. letech 20. století. Léčebný účinek přetrvá déle a může se prodloužit doba mezi jednotlivými injekcemi. To jednak výrazně zvýší pohodlí klientů, ale také zmírní pokles hladin faktoru v krvi před další dávkou. Profylaxe je v současné době přizpůsobena tomu, aby hladina chybějícího srážecího faktoru neklesala pod jedno procento. S novým mechanismem účinku. Nově vyvíjené produkty mají být založeny na zcela jiném fungování a tím mít citelnější dopad na stavění i prevenci krvácení. To je obzvláště důležité u hemofiliků s inhibitory (protilátkami proti srážecím faktorům), pro které nejsou dnešní produkty tak účinné jako pro hemofiliky bez inhibitorů.