Anémie Bourková L., OKH FN Brno Sledování vyšetření Sledovat: • hloubku anémie v KO • morfologické změny erytrocytů v periferní krvi (barevné, tvarové, inkluze) • morfologické a množstevní změny erytrocytární populace v KD Příklady vyšetření RBC v krevním obraze M F M FM F N N N N ↓ ↑ ↑ ↑↑ ↑ ↓ ↓ Vyšetření retikulocytů Barvení RNA v erytrocytech: • mikroskopicky –supravitální barvení (bez fixace preparátu) • analyzátorem –analýza prošlého a odraženého světla –analýza fluorescence Hodnoty retikulocytů v periferní krvi odráží schopnost erytropoézy v kostní dření. Mikroskopické vyšetření retikulocytů • V retikulocytech se barví supravitálně (bez fixace) brillantcresylovou modří zbytky RNA. • Pozitivita se hodnotí v 1000 erytrocytech – normální hodnoty: 0,5 – 2,5 % Vyšetření retikulocytů na analyzátoru • analýza prošlého a odraženého světla probíhá v retikulocytech na precipitovaných, obarvených síťových strukturách RNA • fluorescenční analýza vlákna RNA jsou obarvena fluorescenčními barvami, množství RNA je úměrné intenzitě fluorescence • Normální hodnoty: 0,5 – 2,5 % 25 – 100 x 109/L Cytochemické vyšetření zásobního Fe • Zásobní (nehemové) železo ve formě Fe3+ (feritin, hemosiderin)  v erytrocytech  NRBC  makrofázích • Princip: Fe3+ tvoří s ferrokyanidem draselným a kyselinou chlorovodíkovou barevný komplex – berlínskou modř • Hodnocení: zelenomodrá granula  v erytrocytech (siderocyty)  v NRBC (sideroblasty)  zrnka v NRBC okolo 2/3 jádra (prstenčité sideroblasty)  v makrofázích (siderofágy) • Normální hodnoty: 20 – 60 % pozitivních NRBC 2 - 4 siderofágy ze 6 nalezených makrofágů • Klinický význam: anémie  např.: sideropenické (nízké hodnoty)  sideroblastické (přítomné prstenčité sideroblasty, zvýšené zásobní Fe)  hemolytické anémie (vysoké hodnoty)  refrakterní anémie (vysoké hodnoty) Barvení Fe 3+ prstenčitý sideroblast siderofágy Barvení Fe 3+ Porucha syntézy hemu Sideropenická anémie (nedostatek železa) • KO: pokles HGB, MCV, vyšší RDW, vyšší PLT, lehce vyšší Retic • nátěr PK: hypochromní mikrocyty, anulocyty, poikilocyty, bazofilní tečkování • nátěr KD: vyšší erytropoéza, NRBC - opožděné vyzrávání cytoplazmy, vyšetřování zásobního Fe (hodnoty snížené nebo nulové) Sideropenická anémie Porucha syntézy globinu Thalasemie • KO: nižší nebo normál. RBC, nižší nebo normál. HGB, výrazně snížené MCV, vyšší RDW, lehce vyšší WBC, lehce vyšší PLT, zvýšený Hgb F (až nad 30%) • nátěr PK: mikrocytóza, hypochromie, terčovité ery, polychromázie, bazofilní tečkování, H.J.tělíska, bazofilní tečkování, NRBC, mladší formy WBC • nátěr KD: hyperplazie erytropoézy, vyšetření zásobního Fe (hodnoty zvýšené) Thalasemie terčivitý RBC kostní dřeň Porucha syntézy DNA Megaloblastové anémie • KO: MCV >100fl, HGB až pod 50g/L, vyšší RDW, snížení WBC, NE, PLT • nátěr PK: makroovalocytóza, poikilocytóza, Cabotovy prstence, bazofilní tečkování, H.J. tělíska, NRBC, NE hypersegmentace, větší buňky, větší laločnatost jader i u monocytů, velké až gigantické PLT • nátěr KD: buněčně bohatá, erytropoéza zmnožená, posun k mladším formám, (megaloblastová přestavba ve všech vývojových řadách), velké tyče, metamyelocyty, hypersegmentace MGK, vyšetření zásobního Fe (hodnoty zvýšené) Příklad KO s makrocytární anémíí při MDS NRBC Megaloblasty NRBC X Megaloblast Megaloblastová anémie Megaloblastová anémie megakaryocyt Aplastické anémie - dřeňový útlum • porucha kmenové (mateřské) buňky • periferní krev: pancytopenie nebo alespoň anemie a trombocytopenie, mírná makrocytóza a anizocytóza • kostní dřeň: obvykle hypoplastická až aplastická Aplastické anémie KD Dysplastické anémie • dysplázie erytropoézy: porucha vyzrávání, morfologické abnormality  periferní krev: makrocytóza, anizocytóza,poikilocytóza,  kostní dřeň: často megaloidní rysy, vícejaderné NRBC, karyorexe, interplazmatické můstky, mitózy, bývají zvýšené zásoby Fe Anemie ze zvýšené ztráty erytrocytů Sledovat: • KO a morfologické změny v periferní krvi • změny v KD • vyšetření na HA Příklady krevních obrazů při ztrátě erytrocytů krvácivý stav schistocyty - 5 krvácivý stav schistocyty - 60 Vyšetření na hemolytické anémie (HA) např.: • volný hemoglobin v plazmě  základní metodika pro vyšetřování hemolýzy v plazmě  haptoglobin  feritin  elektroforéza hemoglobinu Speciální vyšetření: • osmotická rezistence • hemosiderin v moči • hemoglobin F • Heinzova tělíska • autohemolýza Princip základní metodiky • Volný hemoglobin v plazmě Volný hemoglobin Hb(Fe2+) v plazmě je stanoven fotometricky po jeho oxidaci na hemiglobin (Fe3+) a ten se potom pomocí kyanidu (CN-) draselného přemění na barevný komplex hemiglobinkyanidu, stanovitelný fotometricky. Osmotická rezistence • Princip Stanovení odolnosti erytrocytů vůči různě koncentrovaným hypotonickým roztokům NaCl v koncentracích od 0,70 % do 0,22 % (odstupňované po 0,02 %). Jestliže jsou erytrocyty v isotonickém roztoku 0,9% NaCl, dochází na membráně buňky k rovnovážnému stavu a kapalina se nedostává ani z buňky ani do buňky. Jestliže jsou erytrocyty umístěny v prostředí hypotonického roztoku (0,70 - 0,22 % NaCl) tak buďto prasknou a dojde k hemolýze nebo se vytvoří na membráně rovnováha. • Klinický význam snížená rezistence – dědiční sférocytóza zvýšená rezistence – talasémie, polycytémie Osmotická rezistence normální výsledek inkubace příprava fyziologický roztok – kontrola (bez hemolýzy) 0,9% voda voda – kontrola (absolutní hemolýza) 0,9% voda kontrolní prostředí patologický výsledek inkubace snížená rezistence zvýšená rezistence snížená rezistence Hemosiderin v moči • Princip Fe3+ v hemosiderinu reaguje s kyselým roztokem ferrokyanidu draselného na ferrokyanid železitý, který vytváří krystalky berlínské modři. • Hodnocení přítomnost modrých krystalů v moči – normální nález: negativní – pozitivní nález: + až +++ Hemosiderin v moči Hemoglobin F • Princip Nafixované, zaschlé nátěry se ponoří do pufru pH 3.3. Hemoglobin A (adult hemoglobin) je v buňce rozpuštěn a vyplaven, hemoglobin F (fetální hemoglobin) je ke kyselému prostředí rezistentní a v erytrocytu zůstává. Zbylý hemoglobin F se potom barví a odečítá mikroskopicky. • Hodnocení procentuelní hodnocení sytě zbarvených erytrocytů  novorozenci: 50 - 90 % HbF  věk < 2 roky: 0 - 4 % HbF  věk > 2 roky: 0 - 2 % HbF Hemoglobin F Heinzova tělíska • Princip Heinzova tělíska znázorňují vysrážený degenerovaný hemoglobin v případě, že glykolytické enzymy erytrocytů nejsou schopny zabránit oxidaci hemoglobinové molekuly. Precipitáty se jeví jako jedno nebo více oválných tělísek v erytrocytech. Objevují se těsně u buněčné membrány, ke které přiléhají, barví se supravitálně brillantcresylovou modří. • Hodnocení normalní erytrocyty jsou negativní • Klinický význam enzymové defekty (např.G-6-PDH), hemoglobinopatie, toxické HA, po splenektomii Heinzova tělíska Heinzova tělíska bite cells bite cells Autohemolýza • Fotometrické vyšetření na principu stanovení volného hemoglobinu v plazmě. • Hodnocení spontánní hemolýzy ve třech prostředích po inkubaci 48 hodin:  fyziologický roztok – 0,9% NaCl (hemolýza)  fyziolog. roztok + glukóza (↓ hemolýza u fyziologického vzorku)  fyziolog. roztok + ATP (↓ hemolýza u fyziologického vzorku) Ke korekci hemolýzy nedochází při některých enzymopatiích a poruchách erytrocytární membrány. Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705) 0,9 % NaCl + RBC 0,9 % NaCl + glukóza + RBC 0,9 % NaCl + ATP + RBC po 48 hodinách – fyziologický vzorek 0,9 % NaCl + RBC 0,9 % NaCl + glukóza + RBC 0,9 % NaCl + ATP + RBC po 48 hodinách – patologický vzorek