HLA systém, jeho struktura a funkce HLA (Human Leukocyte Antigens ) = Hlavní histokompatibilní systém člověka (MHC) Historie vHLA systém je soubor vázaných genů na krátkém raménku chromozomu 6 v vMHC geny nejdříve rozpoznány u myší na základě pokusů s transplantacemi tumorů u myší (1930-1940) v70. léta - již známy 3 lokusy I. třídy HLA-A, -B, -C - HLA antigeny definovány sérologickými a buněčnými technikami - účast HLA molekul v imunitní odpovědi v1974- fenomén HLA restrikce ( T lymfocyty rozpoznávají cizorodý antigen pouze v komplexu s HLA molekulami I. nebo II. třídy v80. léta- objev lokusů II. třídy HLA-DR, -DQ, -DP v90. léta- objev tzv. neklasických antigenů lokusů HLA-E, -F, -G, -H, -J, -K, -X - zavedeny techniky HLA typizace na úrovni DNA Struktura HLA systému vNejkomplexnější a nejpolymorfnější systém, každý člověk nese unikátní sestavu HLA alel, výjimka – monozygotní dvojčata v vlokalizace na krátkém raménku 6. chromozomu ( 4100 kb, více než 200 genů ) v vgeny uspořádány do 3 oblastí: HLA I., II., III. třída HLA I. třída (transplantační, klasické antigeny) v vI. třída obsahuje geny HLA –A, -B, -C pro těžký řetězec α HLA molekul v v povrchové glykoproteiny, exprimovány na téměř všech buňkách v neklasické geny HLA-E, -F, -G (glykoproteiny - omezený výskyt) v pseudogeny HLA II. třída v geny pro –α a –β řetězec HLA molekul – DR, -DQ, -DP v v produkty glykoproteiny exprimovány na povrchu tzv. antigen prezentujících buněk (buňky imunitního systému) v v HLA-DM, -DO geny – produkty výskyt v endozomech, funkce - naložení cizorodého peptidu na HLA molekulu II. třídy) v v geny LMP2, LMP7 kódují proteiny, které štěpí cizorodé částice na menší peptidy v v geny TAP1, TAP2, zahrnuty do procesu transportu peptidů do ER n n HLA III. třída vstrukturálně a funkčně odlišné proteiny n v složky komplement C4, C2, faktor B, 21-hydroxylasa, TNF, heat shock protein Hsp 70 n n vHLA molekuly I. a II. třídy jsou glykoproteiny složené ze 2 různých proteinových řetězců (heterodimery) v vHLA molekuly I. třídy mají těžký α- řetězec nekovalentně vázaný s β2- mikroglobulinem (gen pro lehký řetězec β2- mikroglobulin lokalizován na chr. 15) vα- řetězec vytváří 3 domény α1, α2,α3 vα1 a α2 vytváří vazebný žlábek pro cizorodý peptid v vHLA molekuly II. třídy se skládají ze 2 glykoproteinových transmembránových řetězců α, β v vKaždý řetězec je složen do 2 domén - α1, α2, β1, β2 v α1, β1 vytváří vazebný žlábek pro cizorodý peptid v Struktura HLA molekul Polymorfismus HLA - počet alel stále roste Lokus Počet alel Proteiny HLA-A 6921 4156 HLA-B 8181 5090 HLA-C 6779 3927 HLA-E 271 110 HLA-F 45 6 HLA-G 88 26 HLA-DRB1 3018 2063 HLA-DQB1 2033 1324 HLA-DPB1 1862 1180 http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html Funkce HLA systému vPrimární role imunitního systému je rozpoznat a eliminovat nebezpečné cizirodé agens, imunitní systém musí rozlišovat mezi „vlastními“ a „cizími“ antigeny n vHlavní funkcí HLA molekul je předkládat (prezentovat) cizorodé antigeny buňkám imunitního systému, především T lymfocytům v vTato prezentace antigenu je prvním předpokladem pro rozvoj imunitní reakce a tím obrany proti napadení mikroorganismy n vfenomén HLA restrikce - buněčné receptory T lymfocytů (TCR) rozpoznávají cizorodé peptidy pouze vázané v peptidovém žlábku HLA molekuly I. nebo II. třídy v v2 způsoby prezentace antigenů T lymfocytům – endogenní (HLA I. tř.) n - exogenní (HLA II. tř.) q ENDOGENNÍ ZPŮSOB PREZENTACE v HLA molekuly I. třídy v rozpoznání a destrukce virem infikovaných bb. v cizorodé peptidy prezentované molekulami HLA I. tř. odvozené od proteinů produkovaných buňkou - endogenní zdroj vcizorodý peptid + HLA I. tř. CD8+ (Tc lymfocyty) - zabití napadených buněk n EXOGENNÍ ZPŮSOB PREZENTACE n vHLA molekuly II. třídy vvesikulární systém buňky (transportní váček) vexogenní antigeny jsou buňkou pohlcené (endocytóza, endozóm) - bakterie, paraziti - exogenní zdroj v vendosom fúzuje s lysosomem (štěpení proteinu) vfúze endolysozomu s transportním váčkem s HLA II. molekulami vMHC class II loading compartments (MIICs) – naložení peptidu v v ciz. peptid + HLA II CD4+ (Th lymfocyty) - aktivace zánětlivé a protilátkové odpovědi n nCD4+ Th1 - zánětlivé - aktivace makrofágů k zabití patogenu nCD4+ Th2 - protilátková odpověd', aktivace B buněk k produkci protilátek n Peptidy prezentované pomocí HLA I. tř. – endogenní zdroj 1. Syntéza virových proteinů na ribosomech 2. Ubiquitin – označení proteinu k likvidaci 3. Proteasom = proteinový komplex k rozštěpení nepotřebných a poškozených proteinů 4. TAP1/TAP2 – transport peptidů do endoplasmatického retikula 5. Naložení na molekulu HLA I a transport na povrch buňky Peptidy prezentované pomocí HLA II. tř. – exogenní zdroj MHC II ENDOPLASMATICKÉ RETIKULUM α a β řetězec MHC II + invariantní řetězec (Ii, CD74) (zabraňuje obsazení vazebných míst vlastními peptidy)⇒ CLIP (CLass II associated Invariant Chain Peptide) ⇒ HLA-DM ⇒ odstranění Ii a záměna za antigenní fragment EXOGENNÍ ANTIGEN Vesikuly s kyselým prostředím ENDOSOMY LYSOSOMY - proteolytické štěpení (katepsiny, endopeptidáza) HLA molekuly jsou ligandy pro receptory NK buněk vNK buňky (přirození zabíječi), obrana proti infekcím vNK buňky mají na povrchu aktivační a inhibiční receptory, kterými je regulována aktivita NK buněk v Inhibiční receptory rozpoznávají HLA molekuly a také neklasické HLA-E a -G molekuly v vHLA molekuly aktivují nebo blokují aktivitu NK buněk vT lymfocyty rozpoznávají přítomnost HLA molekul (vlastní x cizí) vNK buňky rozpoznávají absenci HLA molekul na povrchu buňky (nádorové b., virem infikované b.) Ochrana fetálního allograftu vPlod v těle matky je z poloviny cizí štěp vKlasické HLA produkty I. třídy –A, -B, nejsou exprimovány na buňkách trofoblastu → T lymfocyty jsou k plodu ignorantní vna trofoblastu jsou syntetizovány HLA-C a neklasické molekuly HLA-G, (-E) → zajišťují inhibici NK buněk v vZávěr: Neklasické HLA-G, (-E) molekuly hrají speciální biologickou roli = ochrana vyvijejícího se fetu před mateřskými T a NK buňkami, hrají roli při potlačení imunitní odpovědi matky proti plodu – navození tolerance úloha HLA molekul v transplantologii vHLA molekuly jsou silné aloantigeny indukující rejekci štěpu v snímek66 087 Fig Placental trophoblast cells – HLA – E, G Glioblastoma neoplastic cells– HLA –E, 400x Fig Exprese a distribuce HLA molekul vHLA I. tř. - nalezeny na všech jaderných buňkách vHLA geny exprimovány kodominantně – obě alely každého HLA lokusu exprimují HLA molekuly vna mladých červených krvinkách – atypický antigenní systém Bga, Bgb, Bgc (reziduální HLA antigeny) vplazma – solubilní HLA antigeny v vHLA II. tř. – omezená distribuce: B lymfocyty, makrofágy, dendritické buňky, Langherhansovy buňky kůže, (buňky imunitního systému) n vexprese HLA antigenů I. a II. třídy může být zvýšena během zánětu, ale také může být indukována na určitých buňkách, na kterých se normálně neexprimují (myocyty, hepatocyty ). vZvýšená nebo nová exprese HLA antigenů je iniciována cytokiny (interferony) n vNová exprese HLA antigenů za určitých podmínek pravděpodobně hraje majoritní roli v patogenezi rejekce transplantovaného štěpu vSnížená exprese HLA molekul - nádorové buňky, virem infikované buňky n v Absence HLA molekul - mechanismus, kterým nádorové buňky a virem infikované buňky obchází imunitní rozpoznání T buňkami. typ buňky, tkáně exprese HLA I HLA II BUŇKY IMUNITNÍHO SYSTÉMU dendritické buňky +++ + makrofágy +++ ++ T lymfocyty +++ + B lymfocyty +++ +++ JINÉ JADERNÉ BUŇKY neutrofilní granulocyty +++ - eosinofilní granulocyty +++ - epitelové buňky +++ - hepatocyty + - nervové buňky + - buňky ledvin + - NEJADERNÉ BUŇKY trombocyty ++ - erytrocyty - - Tab.1.: Odlišnosti v expresi molekul HLA I. a II. třídy na různých buněčných typech ( J. Krejsek a O. Kopecký, Klinická imunologie, str. 125, 2004) Srovnání vlastností a funkce HLA I a HLA II nCharakteristika HLA I HLA II n nStruktura α řetězec + β2m α a β řetězce n nDomény α1, α2 a α 3 + β2m α1, α2 a β1, β2 n nBuněčná exprese téměř všechny jad.buňky APC (B buňky, dendritické n buňky,makrofágy) n nPeptidy vázající místo uzavřené,váže 8-9 amk otevřené, váže 12-17amk n tvořené doménami α1 a α2 tvořené doménami α1 a β1 n nPeptidy endogenní antigeny exogenní antigeny n nPeptidy prezentované CD8+T buňkám CD4+T buňkám Dědičnost HLA systému v geny vázané X geny volně kombinovatelné v vHLA geny jsou vázané → děděny „en bloc“ od rodičů jako haplotyp v vněkdy rekombinace v HLA oblasti (crossing-over během meiotického dělení) → výměna genetického materiálu mezi homologickými chromozómy → vznikají rekombinantní sestavy alel v vfrekvence rekombinace je závislá na vzdálenosti mezi geny v vvazebná nerovnováha ( linkage disequilibrium ) n - běžná v HLA systému n - určité kombinace alel se vyskytují častěji, než by se očekávalo na základě genový frekvencí vevoluční základ vazebné nerovnováhy je spekulativní, určité kombinace HLA alel asi poskytují v některých populacích určitou selekční výhodu n nNapř. HLA- A1 a HLA-B8 s genovými frekvencemi 0,16 a 0,1 v populaci. Očekávaná frekvence výskytu haplotypu HLA –A1, B8 v populaci by měla být 0,16x 0,1x100%= 1,6%. V některých kavkazských populacích frekvence tohoto haplotypu zdaleka přesahuje očekávanou frekvenci ( 8% ) n Nejčastější haplotypy v různých etnických skupinách n n African Asian Caucasian n Haplotype (freq.%) n 1.A30,B42,DR3 (1,67) A33,B58,DR3 (1.58) A1,B8,DR3 ( 5,18) 2. 2.A1,B8,DR3 (1,25) A33,B44,DR6 (1,46) A3,B7,DR2 (2,63) 3. 3.A3,B7,DR2 (0,76) A24,B52,DR2 (1,38) A2,B44,DR4 (2,15) 4. 4.A2,B44,DR4 (0,65) A2,B46,DR9 (1,35) A2,B7,DR2 (1,8) 5. 5.A33,B53,DR8 (0,63) A33,B47,DR7 (1,34) A29,B44,DR7 (1,47) ♀ ♂ a b c d A2 A24 A1 A3 B7 B44 B8 B27 DR4 DR17 DR1 DR8 a c a d b c b d A2 A1 A2 A3 A24 A1 A24 A3 B7 B8 B7 B27 B44 B8 B44 B27 DR4 DR1 DR4 DR DR17 DR1 DR17 DR8 Dědičnost HLA haplotypů Vznik nerekombinantních a rekombinantních HLA haplotypů HLA asociovaná onemocnění v1967 – první zprávy o asociaci HLA systému s onemocněním u člověka v v1973 – objevena asociace HLA-B27 s ankylozující spondylitidou (m. Bechtěrev) v vnásledně byly studovány stovky onemocnění pro možnou asociaci onemocnění s HLA systémem v vu více než 50-ti onemocnění byla prokázána statisticky významná HLA asociace n vHLA asociované choroby jsou nemaligní chronická onemocnění v vpřevážně autoimunitní onemocnění v vvětšina chorob je multifaktoriálních ( geny+ environmentální složka) n vspouštěčem často environmentálním faktory (mikroorganismy, stres) n Některé příklady asociace HLA alel s chorobou: Birdshot retinopathy -A29 RR=200 Ankylosing spondylitis -B27 81,8 Narcolepsy -DQB1*06:02 100 Psoriasis vulgaris -B13, Cw6 4,5 7,2 Celiac disease - DQB1*02, DQA1*05 (DQ2.5) 13,3 - DQB1*03:02, DQA1*03:01 (DQ8) Type I diabetes mellitus - DQB1*02, DQA1*05 10 - DQB1*03:02, DQA1*03:01 Multiple sclerosis -DQ6 4 Rheumatoid arthritis -DR4 4 ANKYLOSING SPONDYLITIS (AS, M. BECHTĚREV) vAsociace s HLA-B27 v vzánětlivá forma artritidy, postižení ve větší míře mladí muži v vpostižení začíná obvykle v dolní části páteře, kde zánět napadá kloubní spojení mezi pánví a páteří , nemoc se může postupně šířit nahoru a dolů ke kyčelním a kolenním kloubům. v vrůzný průběh onemocnění, může končit velmi vážnými deformitami v vprůběh onemocnění dlouhodobý v vostatní choroby asociované s HLA-B27 – Reiterova choroba (revmatické onem.,často vyvolávají chlamydie, trojice obtíží: neinf.zánět kloubů, moč.trubice a spojivek) v v Anterior uveitis (přední uveitida-zánět duhovky, řasnatého tělíska) - TYPE I DIABETES MELLITUS ( IDDM ) vsilná asociace s DQA1*05:01/DQB1*02:01 a DQA1*03:01/DQB1*03:02 v kavkazské populaci DQA1*05:01/DQB1*02:01 u amerických černochů DQA1*05:01/DQB1*03:02, DQA1*03:01/DQB1*04:01, DQA1*03:01/DQB1*03:03 u Japonců v vprotektivní účinek vůči IDDM je asociován s DQB1*06:02 (DQA1*01:02/DQB1*06:02 ) vIDDM se vyvíjí postupně, dlouhá subklinická etapa spojená s postupujícím poškozením beta buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu, které tvoří inzulin, klinický projev – zničeno asi 90% buněk v vza rozvoj onemocnění zodpovědno více faktorů – geny a negenetická složka ( infekce enteroviry = polioviry, coxsackieviry A, B, echoviry ) vvětšina nákaz virem je asymptomatická CELIAC DISEASE (CD) -predispoziční haplotypy -DRB1*03- DQA1*05:01- DQB1*02:01 -DRB1*07- DQA1*02:01- DQB1*02:02 -DRB1*04 -DQA1*03:01-DQB1*03:02 v geneticky podmíněné autoimunitní onemocnění v v intolerance na gluten (lepek), trávicí soustava pacienta není schopna trávit potraviny obsahující lepek v vchronický zánět sliznice tenkého střeva, prevalence v ČR 1 : 200-250 obyv. v pro vývoj onemocnění nutné 3 podmínky: 1. genetické předpoklady 2. konzumace stravy obsahující lepek 3. spouštěč onemocnění ( stres, trauma, virová infekce ) v dlouhodobé průjmy, únava, bolesti kostí, břicha, svalů, u dětí také problémy se zuby, růstem a vývojem v jediná známá léčba – celoživotní dodržování bezlepkové diety - - - - - - MULTIPLE SCLEROSIS (MS) v slabší asociace s HLA alelami DRB1*15:01, DQB1*06:02 a DQA1*01:02 v vliv faktory genetické i negenetické (vliv prostředí, neznámé imunologické procesy) vchronické zánětlivé demyelinizující onemocnění centrálného nervového systému s nejasnou etiologií a patogenezou - NARKOLEPSIE vneurologické onemocnění, v ČR 2500-5000 osob vhypersomnie – zvýšená denní spavost někdy doprovázená kataplexií (ochabnutí kosterního svalstva) vpravděpodobně autoimunitní onemocnění s dědičným sklonem nastartované vnějším faktorem (streptokoková infekce) namířené proti hypocretinovým neuronům, které mají budivou funkci HLA nomenklatura 1. Serologická definice HLA antigenů – maximálně 2 znaky 1. v antigeny základní – např. A9, A10, B51, B40, Cw3, DR2, DQ3…. v antigeny splitové (subtypy) - sdílejí společné sérologicky definované epitopy např. A10→ A25, 26, 34 B40→ B60, 61 Cw3→ Cw9, 10 DR2→ DR15, 16 DQ3→ DQ7, 8, 9 vantigeny obecné – DR51, DR52, DR53 v V r. 1987 – 10th International Histocompatibility Workshop, přijata nomenklatura založená na následujících principech: v HLA= Hlavní histokompatibilní komplex člověka v A, B, C, DR, DQ, DP..…lokusy v číslo (A1, Cw3) = označení specifity molekuly (antigenu) 2. Molekulárně-genetická definice HLA alel používá znaky dvou a vícemístné HLA-A*02, *31, B*08, *44, C*02, *12, DRB1*04, *13, DQB1*03, *08 - úroveň „low resolution“ HLA-A*01:01, *02:02, B*07:01, *35:01, C*02:02, *03:03, DRB1*04:01, *13:05, DQB1*03:04, *03:05 - úroveň „high resolution“ - Někdy více jak 4 znaky: C*02:02:01, *02:02:02………alely se liší v tiché nukleotidové substituci na úrovni DNA, ne v aminokyselinové sekvenci na úrovni polypeptidu (tichá mutace) A*24:02:01:01 7. a 8. pozice – polymorfismus v nekódující oblasti A*24:02:01:02L „ low expressed“ allele B*51:11N „ null“ allele Metody typizace HLA antigenů 1. serologické metody Complement –Dependent Cytotoxicity Assay ( CDC) = Lymfocytotoxický test ( LCT ) vlymfocyty typovaného jedince jsou nejdříve inkubovány se specifickými antiséry, která jsou rozkapána na mikrotitračních plotnách v vpřidáno králičí sérum jako zdroj komplementu v vvazba protilátky se specifickým HLA antigenem na membráně lymfocytu aktivuje komplement, který poškozuje buněčnou membránu v vvitální barvení ( trypanová modř, eosin ), mrtvé buňky se obarví v vmikroskopické hodnocení, hodnotí se procento obarvených ( mrtvých ) buněk, síla reakce -, 2, 4, 6, 8 v nehodnotitelný výsledek - 0 P1010737 Obraz040 C:\Users\7767\Documents\fotky HLA\LCT 1.jpg C:\Users\7767\Documents\fotky HLA\LCT 2.jpg C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_101456.jpg 2. molekulárně-genetické metody PCR – enzymatická metoda in vitro, která slouží k namnožení ( amplifikaci ) specifického úseku DNA vymezeného párem specifických primerů. 3 kroky – izolace DNA ( plná krev,bukání stěry, krevní skvrny, vlasové folikuly, parafínové tkáňové bloky) - amplifikace DNA ( PCR ) - detekce PCR produktu Počet kopií DNA - 2n n – počet cyklů (30 – 35) ADN_animation HLA typizace pomocí PCR metod PCR – SSP( sequence – specific priming) PCR – SSO ( sequence – specific oligonukleotide probes ) PCR – SBT ( sequence based typing ) Real-Time PCR NGS – sekvenování nové generace C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_101125.jpg 1. PCR – SSP vjednotlivé páry primerů určují jednu alelu nebo skupinu alel (alelově a skupinově specifické primery), rozlišení během PCR v vtolik primerových párů, aby mohly být amplifikovány a detekovány všechny známé alely daného lokusu vPCR – SSP může být užita pro „low resolution“ nebo „ high resolution“ vHLA typizace „ low resolution“pro lokusy -A, -B, -DR, -DQ vyžaduje 95 – 100 primerových párů v v každé zkumavce tzv. interní kontrola amplifikace v kontrola kontaminace – zkumavka obsahuje všechny reagencie pro PCR kromě templátové DNA vDetekce elektroforeticky, amplikony s menší molekulovou hmotností migrují v gelu rychleji než amplikony s vyšší molekulovou hmotností v vizualizace – obarvení gelu fluorescenční barvou, která se inkorporuje do DNA, expozice gelu UV světlem na transiluminátoru vfotodokumentace Princip SSP-PCR ADN_animation úplná shoda – amplifikace proběhne neshoda – amplifikace neproběhne snímek66 027 snímek66 088 2. PCR–SSO typizace na analyzátoru Luminex Fluoroanalyzátor LUMINEX C:\Users\7767\Pictures\IMG_20150904_100208.jpg 3. Real –Time PCR 4. PCR – SBT vpoužutí ddNTPs ( dideoxy nucleotide triphosphates, chybí 3´-OH skupina ), které fungují jako terminátory PCR reakce vddNTPs značeny 4 různými fluorescenčními barvivy, PCR probíhá v 1 zkumavce a elfo v 1 linii vsekvenátor – probíhá kapilární elektroforéza, produkty rozdělovány podle velikosti (rozdíly v délce o 1 nukleotid), laserový paprsek snímá koncový fluorescenčně značený ddNTP vinterpretace výsledků pomocí softwaru q 5. NGS = sekvenování nové generace vamplifikace vpříprava genové knihovny vpříprava templátu vsekvenování vanalýza