HLA SYSTÉM, JEHO STRUKTURA A FUNKCE HLA (Human Leukocyte Antigens ) = Hlavní histokompatibilní systém člověka Struktura HLA systému • Nejkomplexnější a nejpolymorfnější systém, každý člověk nese unikátní sestavu HLA alel, výjimka – monozygotní dvojčata • lokalizace na krátkém raménku 6. chromozomu (4100 kb, více než 200 genů), geny uspořádány do 3 oblastí: HLA I., II., III. třída HLA I. třída zahrnuje geny:  –A, -B, -C : jejich produkty glykoproteiny jsou exprimovány na povrchu všech jaderných buněk (transplantační, klasické)  neklasické geny HLA-E, -F, -G (glykoproteiny - omezený výskyt) HLA II. třída zahrnuje geny:  – DR, -DQ, -DP : jejich produkty glykoproteiny jsou exprimovány na povrchu tzv. antigen prezentujících buněk HLA III. třída zahrnuje:  geny kódující strukturálně a funkčně odlišné proteiny než HLA I. a II. tř.  složky komplementu C4, C2, faktor B, 21-hydroxylasa, TNF, heat shock protein Hsp 70 HLA nomenklatura 1.Sérologická definice HLA antigenů • antigeny základní – např. A9, A10, B51, B40, Cw3, DR2, DQ3…. • antigeny splitové (subtypy) - sdílejí společné sérologicky definované epitopy např. A10→ A25, 26, 34 B40→ B60, 61 Cw3→ Cw9, 10 DR2→ DR15, 16 DQ3→ DQ7, 8, 9 • maximálně 2 číslicové znaky V r. 1987 – 10th International Histocompatibility Workshop, přijata nomenklatura založená na následujících principech: - HLA= Hlavní histokompatibilní komplex člověka - A, B, C, DR, DQ, DP..…lokusy - číslo ( A1, Cw3 ) = označení specifity molekuly ( antigenu ) 2. Molekulárně-genetická definice HLA alel • molekulárně-genetická nomenklatura používá znaky dvou a vícemístné: • úroveň „low resolution“ př. HLA-A*02, *31, B*08, *44, C*02, *12, DRB1*04, *13, DQB1*07, *08 • úroveň „high resolution“ př. HLA-A*01:01, *02:02, B*07:01, *35:01, C*02:02, *03:03, DRB1*04:01,*13:05, DQB1*03:04, *03:05 • Někdy více jak 4 znaky: C*02:02:01, *02:02:02………alely se liší v tiché nukleotidové substituci na úrovni DNA, ale ne v aminokyselinové sekvenci na úrovni polypeptidu (tichá mutace) A*24:02:01:01 7. a 8. pozice – polymorfismus v nekódující oblasti A*24:02:01:02L „ low expressed“ allele B*51:11N „ null“ allele Funkce HLA systému • Hlavní fyziologickou funkcí HLA molekul je předkládat cizorodé antigeny nebo jejich fragmenty buňkám imunitního systému, především T lymfocytům • Tato prezentace antigenu je prvním předpokladem pro rozvoj imunitní reakce a tím obrany proti napadení mikroorganismy primární role imunitního systému je rozpoznat a eliminovat nebezpečné cizirodé agens, tzn., že imunitní systém musí rozlišovat mezi „vlastními“ a „cizími“ antigeny. • HLA restrikce - buněčné receptory T lymfocytů (TCR) rozpoznávají cizorodé antigenního peptidy navázané na molekuly HLA I. či II.tř. • 2 způsoby prezentace cizorodých antigenů T lymfocytům:  endogenní (HLA I. tř.)  exogenní (HLA II. tř.) Další funkce • ochrana fetálního allograftu • Plod v těle matky je vlastně cizí štěp, polovina genetické výbavy pochází od otce. • Klasické HLA produkty I. třídy –A, -B, nejsou exprimovány na buňkách trofoblastu → T lymfocyty jsou k plodu ignorantní. Naopak na trofoblastu jsou syntetizovány molekuly HLA-G, (-E) → NK inhibice. • Závěr: Neklasické HLA-G, (-E) molekuly hrají speciální biologickou roli = ochrana vyvijejícího se fetu před mateřskými T a NK buňkami, hrají roli při potlačení imunitní odpovědi matky proti plodu • HLA molekuly jsou ligandy pro receptory NK buněk • HLA molekuly aktivují nebo blokují aktivitu NK buněk přes aktivační a inhibiční receptory ( KIR-killer immunoglobuline-like receptor) • NK buňky rozeznávají také neklasické HLA-E a –G molekuly • úloha HLA molekul v transplantologii • HLA molekuly jsou silné aloantigeny indukující rejekci štěpu Exprese a distribuce HLA molekul • produkty genů HLA I. tř. - nalezeny na všech jaderných buňkách • HLA geny exprimovány kodominantně – oba geny (alely) každého HLA lokusu se vyjádří syntézou polypeptidového řetězce HLA produktu • na mladých červených krvinkách – atypický antigenní systém Bga, Bgb, Bgc (reziduální HLA antigeny ) • plazma – solubilní HLA antigeny • produkty genů HLA II. tř. – omezená distribuce na APC: B lymfocyty, makrofágy, dendritické buňky, Langherhansovy buňky kůže, některé endoteliální buňky Srovnání vlastností a funkce HLA I a HLA II Charakteristika HLA I HLA II Struktura α řetězec + β2m α a β řetězce Domény α1, α2 a α 3 + β2m α1, α2 a β1, β2 Buněčná exprese téměř všechny jad.buňky APC (B buňky, dendritické buňky,makrofágy) Peptidy vázající místo uzavřené,váže 8-9 amk otevřené, váže 12-17amk tvořené doménami α1 a α2 tvořené doménami α1 a β1 Peptidy endogenní antigeny exogenní antigeny Peptidy prezentované CD8+T buňkám CD4+T buňkám Dědičnost HLA systému • geny vázané X geny volně kombinovatelné • HLA geny jsou vázané → děděny „en bloc“ od rodičů jako haplotyp • někdy rekombinace ( crossing-over během meiotického dělení) v HLA oblasti → výměna genetického materiálu mezi homologickými chromozómy → vznikají rekombinantní sestavy alel HLA a choroby • 1967 – první zprávy o asociaci HLA systému s onemocněním u člověka • 1973 – objevena asociace HLA-B27 s ankylozující spondylitidou ( m. Bechtěrev ) • následně byly studovány stovky onemocnění pro možnou asociaci onemocnění s HLA systémem, u více než 50ti onemocnění byla prokázána statisticky významná asociace Rysy HLA asociovaných chorob: • choroby asociované s HLA antigeny jsou většinou nemaligní chronická onemocnění • převážně autoimunitní onemocnění • většina chorob je multifaktoriálních ( geny+ environmentální složka) • Spouštěčem onemocnění často environmentálním faktory (např. mikroorganismy, stres, …) Některé příklady asociace HLA alel s chorobou: Birdshot retinopathy -A29 RR=200 Ankylosing spondylitis -B27 81,8 (M.Bechtěrev) Narcolepsy -DQB1*06:02 100 Psoriasis vulgaris -B13, Cw6 4,5 7,2 Celiac disease - DQB1*02, *03:02 13,3 - DQA1*03:01, *05 Type I diabetes mellitus - DQB1*02, *03:02 10 - DQA1*03:01, *05 Rheumatoid arthritis - DR4 4 Multiple sclerosis -DR2, -DQ6 4 Typizace HLA antigenů  Pro účely transplantace nebo krevní transfuze (trombocytové TP) - vyšetření dárce i příjemce  vyšetření HLA znaků asociovaných s chorobami • 1. Serologické metody • Lymfocytotoxický test ( LCT ) • Lymfocyty inkubovány se specifickými HLA antiséry, po přidání komplementu dojde k proděravění membrány lymfocytů s navázanou protilátkou (obarvení) • Hodnotí se skóre mikroskopicky • 2. Molekulárně-genetické metody • Polymerázová řetězová reakce (PCR) • Izolace DNA, amplifikace DNA, detekce produktu PCR Terasakiho deska Transplantace • Transplantace orgánová – srdce, játra, ledviny, plíce, kombinované Tx • 2 typy dárců – kadaverózní dárce a dárce žijící • Transplantace kostní dřeně, periferních kmenových buněk, pupečníkové krve • Podle typu dárce Tx autologní, alogenní, syngenní • Alogenní transplantace – příbuzenecká, nepříbuzenecká • Registry dárců Registry dárců kostní dřeně v ČR • Český národní registr dárců dřeně (ČNRDD) - Plzeň • Český registr dárců krvetvorných buněk (CSCR) - Praha • Podmínky pro vstup do registru: • věk 18-35 let • dobrý zdravotní stav, žádné závažné onemocnění v minulosti • ochota překonat určité nepohodlí a ztrátu času, spojené s jednou či několika návštěvami zdravotnického zařízení, případně s odběrem krvetvorných buněk v zájmu záchrany života druhého člověka. Požadavky na dárce orgánů - kadaverózní dárci  Kadaverózní dárce orgánů je osoba s prokázanou mozkovou smrtí při zachovalém krevním oběhu, s funkčními orgány a bez přítomnosti kontraindikace dárcovství.  Zákon č.285/2002 Sb. určuje přesná pravidla na určení mozkové smrti a souvisejících předpisů včetně požadavků na kvalifikaci odborníka potvrzující mozkovou smrt.  V ČR platí předpokládaný souhlas s dárcovstvím, osoby nesouhlasící s dárcovstvím mají právo se přihlásit do speciálního registru osob nesouhlasících s dárcovstvím (registr NROD) .  Pracoviště zvažující dárcovství musí ověřit, zda pacient v tomto registru není. Souhlas rodiny není zákonně nutný, ale obvykle se bez souhlasu rodiny dárcovství neuskuteční.  Nejčastější dárci jsou s úrazy hlavy, nitrolební krvácení a další, první informaci o možném dárci podává ošetřující lékař do spádového transplantačního centra ještě před ověřením smrti mozku.  Smrt mozku je ze zákona potvrzována komplexem vyšetření (angiografie-znázornění oběhu krve kontrastní látkou, kdy se prokáže zástava kr. oběhu mozku). Požadavky na dárce orgánů - žijící dárci  přibližně 10% dárců představují u nás žijící dárci ledviny (rodiče, sourozenci, jiní příbuzní).  (absolutní kontraindikací pro Tx ledviny od žijícího dárce je onemocnění ledvin, maligní nádory s možností metastáz, přítomnost australského antigenu (riziko přenosu hepatitidy B), pozitivita na HIV a věk do 18 let. Další podmínkou všech Tx ze žijících dárců je vyloučení jednání pod nátlakem či za úplatu)  živý dárce – kratší doba studené ischémie, odběr a Tx jsou naplánované a probíhají prakticky ve stejnou dobu . Tato skutečnost výrazně přispívá k vynikajícím výsledkům Tx od žijících dárců i bez shody v HLA. Nutnou podmínkou je negativní cross-match (křížová zkouška) mezi dárcem a příjemcem a shoda v KS. Protilátky proti leukocytům a trombocytům  V imunologii leukocytů a trombocytů hrají důležitou roli imunoglobuliny třídy IgG, IgM a IgA  Antigeny leukocytů • 1.antigeny společné s erytrocytárními – AB0, Rh, P, MNSs, … • 2. antigeny specifické pro leukocyty • specifické antigeny lymfocytů HLA antigeny • specifické antigeny granulocytů HNA antigeny • specifické antigeny monocytů HMA antigeny  Antigeny trombocytů • 1.antigeny společné s erytrocytárními – AB0, Le, P, I, … • 2. HLA antigeny I.třídy (HLA-A, -B a -Cw) • Specifické antigeny trombocytů HPA antigeny Anti-HLA protilátky • Silné imunogeny • způsobují komplikace v těhotenství, po transfuzích a transplantacích • Klinické syndromy způsobené anti-HLA protilátkami: Febrilní nehemolytická potransfuzní reakce – FNHTR (teplota, třesavka, zimnice, bolest hlavy)  příčinou mediátory a cytokiny z leukocytů uvolněné v průběhu zpracování a skladování TP  někdy je příčinou přítomnost antileukocytárních (částo a-HLA) protilátek v plazmě pacienta při podání TP kontaminovaných leukocyty  Snížení výskyty FNHTR – plošná leukodeplece TP Potransfuzní reakce TRALI - imunní TRALI (poškození plic způsobené transfuzí)  a-HLA nebo antigranulocytární protilátky v plazmě DK reagující proti antigenům leukocytů příjemce transfuze nebo antileukocytární protilátky v plazmě příjemce transfuze reagující proti antigenům leukocytů přítomných v TP  aktivované leukocyty - obstrukce plicní mikrocirkulace, vzniká plicní edém  klinické projevy do 6 hodin po podání transfuze (většinou neprodleně po zahájení transfuze) Anti-HLA protilátky Klinické syndromy způsobené anti-HLAprotilátkami Refrakterita  refrakterita na podání trombocytových transfuzních přípravků způsobená přítomností anti-HLA protilátek v séru pacienta reagujícími s HLA antigeny I. třídy nacházejících se na membránách trombocytů dárce  výběr HLA kompatibilního dárce transfuzního přípravku z registru HLA otypovaných dárců nebo zkouška kompatibility v lymfocytotoxickém testu mezi sérem příjemce a lymfocyty dárce (cross-match) Akutní rejekce  odvrhnutí transplantovaného štěpu  pravděpodobnost vzniku akutní rejekce je tím větší, čím větší odlišnosti v HLA systémech dárce a příjemce existují  úloha non-HLA faktorů Systém HNA (Human Neutrophil Antigens) • Známo 7 antigenů, které jsou uspořádány do 5 HNA systémů Klinické syndromy způsobené anti-HNA protilátkami Aloimunitní neutropenie novorozence • způsobená mateřskými aloprotilátkami proti HNA antigenům na neutrofilech plodu při absenci na neutrofilech mateřských • nebo jako transplacentární přenos protilátek od matky s autoimunitní neutropenií Potransfuzní reakce TRALI a FNHTR • viz. výše Autoimunitní neutropenie u dětí • vyvolaná antigranulocytárními autoprotilátkami nejčastěji proti HNA-1a, HNA-1b, HNA-2a, HNA-4a HPA antigeny • Antigeny specifické pro trombocyty • Nachází se na glykoproteinech destičkových membrán, většina HPA antigenů je součástí GPIIb/IIIa • na trombocytech 6 bialelických systémů - HPA-1, HPA-2, HPA-3, HPA-4, HPA-5, HPA-15 (33 HPA alel na 6 glykoproteinech) Anti-HPA protilátky  antitrombocytární protilátky jsou vetšinou třídy IgG, často také IgM a zřídka IgA  v kavkazké populaci je protilátka proti antigenu HPA-1a nejčastější příčinou fetomaternální aloimunitní trombocytopenie  antitrombocytární protilátky vznikající jako odpověď imunitního systému na HPA antigen, se dělí: • aloprotilátky (po transfuzi, po transplantaci, v průběhu těhotenství) • autoprotilátky způsobující destrukci vlastních trombocytů (autoimunitní trombocytopenie, ITP) • léky indukovaná trombocytopenie (antiepileptika, analgetika, antibiotika)