ZÁKLADNÍ KONCEPTY
ASISTOVANÉ
REPRODUKCE
(podzim 2022)
Zuzana Holubcová
zholub@med.muni.cz
Doporučený postup dle ČGPS ČLS 21.1.2021
Vyšetření poruch plodnosti
- indikováno z párů, u kterých nedošlo k
otěhotnění po 12 měsících pravidelného,
nechráněného pohlavního styku (2-3. týdně!)
- u žen nad 35 let je vzhledem na věkem
podmíněný pokles plodnosti vhodné zahájit
léčbu už po 6. měsících
- rychlejší zahájení léčby doporučeno i při
 podezření/prokázání snížené plodnosti
muže
 endometrióze
 oligo-amenorrhoe
 tuboperitoneálním faktoru sterility
Vyšetření poruch plodnosti
 Anamnéza
- vstupní konzultace páru rodinná a osobní
zdravotní historie s ohledem na možné rizikové
faktory neplodnosti:
- brzká menopauza v rodině
- vrozené vývojové vady v rodině
- historie neplodnosti v rodině
- předchozí těhotenství/poporodní komplikace
- doba trvání poruch plodnosti
- pravidelnost a délka menstruačního cyklu
- bolestivost menstruace a pohlavního styku
- chirurgické zákroky v dutině břišní
- úrazy varlete nebo malé pánve
- výskyt pohlavně přenosných chorob
- prodělané urogenitální infekce
- užívání léků a návykových látek
- životní styl
- ...
Vyšetření poruch plodnosti
 Diagnostika
1. vyšetření ovariálních funkcí a stanovení ovariální rezervy
- hormonální profil (FSH, LH, AMH, estradiol, TSH, PRL, vitD,..), ultrazvuk (vaječník + endometrium)
2. vyšetření andrologického faktoru
- spermiogram (opakovaný s odstupem 3 měsíců)
- případně hormonální profil (FSH, LH, testosteron, TSH, PRL)
3. vyšetření děložního faktoru (vývojové vady dělohy)
- utrazvuk vaginální sondou, sonohysterografie, hysterosalpingorafie, diagnostická hysteroskopie
4. vyšetření tubárního a tuboperitoneálního faktoru
- vyšetření průchodnsti vejcovodů (hysterosalpingografie, laparoskopie)
- vyšetření přítomnosti periadnexiálních adhezí a endometriózy (laparoskopie, transvaginální
hydrolaparoskopie)
5. genetické vyšetření páru
- průkaz nosičství monogenní poruchy nebo strukturálních aberací → etiologie neplodnosti + indikace
ke genetickému vyšetření embrya
6. vyšetření imunologického faktoru
- až v případě 2 neúspěšných cyklů a při známé diagnóze poruchy imunity některého z partnerů
7. další vyšetření v rámci léčby v programu asistované reprodukce
- např. trobofilní mutace, integrita DNA spermií, příprava receptivního endometria
Ovulace
• Monoovulace = v rámci měsíčního cyklu uvolněn jeden oocyt, u kterého bylo
dokončeno první meiotické dělení a došlo k zástavě v metafázi druhého meiotického
dělení (MII oocyt)
 Klomifen (p.o.)
- selektivní nesteroidní modulátor estrogenových
receptorů v hypotalamu
- sEmuluje uvolňování GnRH (↑FSH, LH)
- předepisován ženám s poruchami ovulace
(anovulační/oligoovulační sterilita, např. PCOS)
- riziko vícečetného těhotenství
 Letrozol (p.o.)
- inhibitor aromatázy (blok syntézy estrogenů)
- negativní zpětnou vazbou zvýšena produkce GnRH
a tím FSH a LH
- protinádorové léčivo,+ léčba gynekomastie
- Indukce ovulace experimentální, resp. „off-label“
- potenciální riziko vad počatých dětí?
Bromokriptin (p.o.)
- agonista dopaminu redukuje prolaktin
- léčba hyperprolaktinemické amenorhei
 Metformin (p.o.)
- Antidiabetikum, léčba inzulinové rezistence (DM2)
- Empiricky používáno pro stimulaci ovulace u žen s PCOS
Indukce ovulace
Letrozole
Androgens
aromatase
In vivo fertilizace
• vnitřní oplození (teplota, pH, osmolarita, oxygence 2-5%, parakrinní signály..)
• fyziologický filtr spermii
• přežití spermií až 5-7 dní
• fúze gamet v ampule vejcovodu
• 6-7 dní sestup do dělohy
• enzymatický hatching
• implantace do endometria
v sekreční fázi cyklu
- úprava ejakulátu (promytí a zakoncentrování) v laboratoři a zavedení katetrem do
dutiny děložní v době kolem ovulace (ultrazvukový monitoring)
- bezbolestný výkon (ambulantně, bez anestezie)
- nejjednodušší, nejlevnější a nejméně invazivní metoda asistované reprodukce
(ART – assisted Reproduction Techniques)
- nízká úspěšnost
Intrauterinní inseminace - IUI
- procedura, při níž jsou odebraná vajíčka a
spermie jen krátce koinkubovány a společně
laparoskopicky umístěny do vejcovodu
- oplození i embryonální vývoj se odehrávají in vivo
- historická metoda (1. „dítě ze zkumavky“ v ČSSR)
Gamete intrafallopian transfer - GIFT
Sperm + egg
X
Zygotic Intrafallopian Transfer (ZIFT)
– do vejcovodu je umístěna zygota vzniklá in vitro
In vivo fertilizace
Ovariální hyperstimulace
- indukce uvolnění více než
jednoho oocytu během cyklu
- monitoring rostoucích
folikulů pomocí ultrazvuku
= hormonální stimulace, superovulace, controlled ovarian stimulation (COS)
- podání exogenních hormonů
o suprese hytotalamohypofyzární
osy
- GnRH agonisti
- GnRH antagonisti
o stimulace růstu folikulů
(resp. potlačení dominance a inhibice
atrézie)
- hMG (FSH+LH)
- rFSH (+LH)
o indukce (trigger) oocytární
maturace
(2-3resp. inhibice atrézie)
- hCG (místo LH)
- subkutánní injekce
(s.c.)
- různé stimulační protokoly (individualizace)
Ovariální hyperstimulace
8-12 vajíček
(MII oocytů)
>18 vajíček
(MII oocytů)
>4 vajíčka
(MII oocyty)
- vliv mají
- Věk
- BMI (Body Mass Index)
- AMH (AntiMüllerian Hormone)
- ukazatel množství primordiálních folikulů
(= ovariální rezerva)
- AFC (Antral Follicle Count)
- počet ultrazvukem viditelných antralních
folikulů
Nežádoucí reakce na stimulaci
 Ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS)
- nejvýznamnější iatrogenní komplikace COH
- ascites, hemokoncentrace, hypalbuminémie,
bolest zvětšených ovárií, riziko trombózy,..
- ovariální odpověď na stimulaci je individuální
Ovariální hyperstimulace
- malé dávky stimulujících hormónů
- méně nežádoucích účinků hormónů
- riziko neúspěšného odběru vajíček
- zisk menšího množství vajíček na oplození
- menší šance na transfer embrya a těhotenství
- menší cena léčby
Minimální ovariální stimulace
= mild IVF/mini IVF
Odběr vajíček
denudace
- odběr oocytů z velkých antrálních preovulačních folikulů
- ultrazvukem naváděná transvaginální punkce ovarií
- obvykle 36-38 hodin po hCG injekci
- provádí se v celkové anestezii
- zisk kumulů (cumulus-oocyte complexes - COCs)
= egg retrieval, oocyte pick-up (OPU), egg aspiration,
ovariální punkce
denudace
(stripping)
= odstranění foliklárních buněk
nezralé oocyty
Oplodnitelné vajíčko
= MII oocyty
= s polárním tělískem
(polar body - PB)
Nativ IVF
= natural cycle, drug-gree IVF
- bez stimulujících hormónů*
- u přilozeně ovulujících žen
- ultrazvukem monitorovaný růst folikulu a odběr vajíčka PŘED ovulací
- miniinvazivní, žádná nebo pouze lokální anestezie
- bez nežádoucích účinku
- vysoké riziko selhání odběru vajíček
- zisk 1-2 vajíček na oplození
- malá šance na transfer embrya a těhotenství
- malá cena léčby
*případně GnRH antagonista ke snížení endogenní hladiny LH k indukci ovulace = „modified natural IVF“
In vitro maturace (IVM)
- odběr nezralých oocytů z
malých antrálních folikulů a
jejich prodloužená inkubace
in vitro
- meiotická maturace
(GV→MI →MII) odebraných
nezralých oocytů v kumulu
(COC) za přítomnosti
hormónů (FSH, hCG, AMH)
- minimální nebo žádná
ovariální stimulace
- pro pacientky s rizikem OHSS nebo onkologických pacientek, u kterých není
bezpečná hormonální stimulace
In vitro maturace
čas
GV MI MII
„Rescue in vitro maturation“
= maturace vývojově zpožděných oocytů („late-maturing oocytes“)
- hormonální „priming“ in vivo
- spontánní dokončení maturace in vitro
v médiu bez hormonů
- krátkodobé dozrávání plně vyrostlých (full-sized, fully-grown) nezralých
oocytů z velkých antrálních folikulů
- vývojově zpožděné oocyty jsou klinicky
využitelné pokud před oplozením
dosáhnou zralosti
- kontrola zralosti = neinvazivní
zobrazení MII vřeténka pomocí
polarizační mikroskopie (PolarizedLight
Microscopy - PLM)
Polarizační mikroskopie
- využíváno ve výzkumu (studium
meiotické maturace in vitro)
Příprava spermií
- zbavení ejakulovaného vzorku seminální plazmy, která obsahuje dekapacitační faktory
- nutno minimalizovat riziko poškození spermií
- životaschopnost a pohyblivost spermií ve vzorku je časově omezená!
1) promytí 2) migrace (swim-up) 3) Hustotní gradient
(density gradient centrifugation)
4) Mikrofluidní systémy 5) MACS
Magnetic Activated Sperm
Sorting
- značení anexinu V magnetickou
značkou → separace poškozených
spermií
Fertilizace in vitro
„Konvenční“ IVF Intracytoplasmatická
Spermatická Injekce (ICSI)
koincubace COCs
+ spemie
denudovaný MII oocyt
+ 1 spemie
Fertilizace in vitro
IMSI
Intracytoplasmic Morphologically-selected
Sperm Injection
PICSI
Physiological Intracytoplasmic
Sperm Injection
- selekce zraých spermií pro ICSI na základě
vazby k hyaluonové kyselině
Fertilizace in vitro
- azospermie (aspsence spermií v ejakulátu)
- mikrochirurgický odběr tkáně z nadvarlete nebo varlete
- izolace spermií z bioptátu
Kultivace embryí
fertilizace
kultivačníplastik
den 0 den 1 den 2-3 den 3 den 4-5 den 5-6
preimplantační vývoj
individuální kultivace
kultivačnímédia
jednostopá (single-step) média
sekvenční (sequential) média
CO2-
MOPS/HEPESpufrovaná
média
5 % 02
6 % CO2
37oC
skupinová kultivace
zygota 2 blastomery 4 blastomery morula kompaktovaná morula blastocysta
Inkubační
podmínky
TLT – time-lapse technique
TLM – time-lapse monitoring
Asistovaný hatching
- umělé vytvoření otvoru*
v Zona Pellucida (ZP)
 mechanicky (jehlou)
 laserem
 chemicky
- cílem usnadnění
hatchingu embrya
- riziko poškození embrya?
* případně mechanické vytažení embrya ze ZP
Kryoprezervace
Mrazit lze:
 Embrya - pomalé mražení/vitrifikace
 Oocyty - vitrifikace
 Spermie - pomalé mražení
 Reprodukční tkáně - pomalé mražení/vitrifikace
- hluboké zamražování při zachování životaschopnosti po
rozmražení
- dlouhodobé skladování v -196oC (tekutý dusík - LN2)
- voda vytěsněna kryoprotektanty
 Zachování plodnosti (fertility preservation)
 Medical freezing – zdravotní důvody
(onkologická diagnóza)
 Social freezing – důvody sociální
(reprodukční stárnutí)
 Léčba neplodnosti (mražení nadbytečných
embryí, freeze all)
 Banky gamet (sperm banky, egg banky)
 Genetické testování (čas pro analýzu DNA)
Preimplantační genetické testování
Biopsie pólového tělíska
GENETICKÁ ANALÝZA
Biopsie trofoektodermuBiopsie blastomer
FISH
aCGH
NGS
BIOPSIE
Preimplantační genetické testování
Preimplantační genetická diagnostika (PGD)Preimplantační genetický
screening (PGS)
Selekce embrya bez strukturních přestaveb/mutace
→ zabránění vzniku (resp. zdědění) nemoci
Selekce embrya s nejvyším implatačním potenciálem
→ zkrácení doby k otěhotnění
Transfer embryí
- přenos embrya/embryí do
dělohy
- provádí se katetrem
- naváděno ultrazvukem
- tloušťka endometria 7-12mm
- obvykle bez sedace nebo
anestezie
- single/double/triple...embryo transfer
- preferován přenos pouze embrya!
(ostatní případně zamraženy)
- multiple-embryo transfer = riziko vícečetného
těhotenství a případné fetoredukce
- těhotenský test prováděn 14-15. den po přenosu
- přenašené embryo:
- D3-D7 (obvykle D5-D6)
- čerstvé (ET) nebo po rozmražení (FET/KET)
Příprava endometria
Implantační okno
(window of implantation-WOI)
-optimální časové období pro implantaci embrya
- analýza endometriálního faktoru
prováděna při opakovaných
implantačních selháních/časných
potratech geneticky normálních embryí
- biopsie endometria
 Expresní profil
- DNA microrray (ERA)
- micro-RNA (MIRA)
 Endometriální mikrobiom
- kultivace (EMMA)
- molekulární (ALICE)
MIRA
Pracovníci IVF kliniky
 Lekaři
- odborné konzultace s pacientem
+ komunikace případu s dalšími
odborníky (laboratoř, genetik, urolog, imunolog..)
- obvykle hlavní lékař (+ sloužící)
- LF + atestace v oboru gynekologie
(vedoucí lékař navíc atestace z
reprodukční medicíny +3-5 let praxe)
Činnosti:
- konzultace léčebné strategie a výsledku léčby
- vedení případové dokumentace
- sběr rodinné a osobní anamnézy
- hodnocení hormonálního profilu
- ultrazvukové vyšetření
- návrh stimulačního režimu
- předpis léků
- folikulometrie
- odběr oocytů (spolupráce s anesteziologem)
- příprava endometria
- transfer embrya
- případně další sledování těhotenství
Organizace IVF kliniky
 Sestry
- SŠ, případně Bc VŠ
- asistence lékaře (ultrazvuk, punkce, transfer)
- odběr krve, vážení, měření tlaku,..
- vysvětlení předepsaných léků
- péče o pacientku po anestezii
- péče o dárkyně
- administrativa a archivace lékařské dokumentace
 Koordinátoři/koordinátorky
- nezdravotnické povolání
- jazyková vybavenost + znalost IVF praxe)
- laický „průvodce IVF léčbou“ pro pacienty ze
zahraničí
- komunikace neodborných otázek v cizích jazycích
(např. organizace cesty/ubytování, zajištění léků)
- psychická opora
- dlouhodobé sledování (follow-up) případů
„IVF turism“
Organizace IVF kliniky
 Andrologové
- komunikace odběru ejakulátu s pacientem
- vyšetření spermiogramu
- příprava vzorku spermatu pro oplození
- mražení/rozmražování spermií
- vedení dokumentace o laboratorních výkonech
- konzultace výsledku vyšetření s pacientem
 Embryologové
- vyhledávání COC v punktátu
- IVM
- denudace oocytů
- hodnocení morfologie a zralosti oocytů
- oplozovací techniky (ICSI, IVF, IVM, PICSI, IMSI)
- kultivace embryí a hodnocení vývoje
- asistovaný hatching
- výběr embryí k transferu přenosu a mražení
- transfer embrya (nasátí do katetru)
- mražení/rozmražování embryí/oocytů/reprodukčních tkání
- biopsie pro účely genetického vyšetření
- vedení dokumentace o laboratorních výkonech
- konzultace s lékařem/pacientským párem
Organizace IVF kliniky
 Andrologové + Embryologové
- VŠ přírodovědného směru (PřF, LF, FaF, FVL,...)
- pro samostatný výkon povolání nutné absolvovat tzv. AKK kurz pro „získání odborné způsobilosti
k výkonu zdravotnického povolání“ - Laboratorní metody v asistované reprodukci
- absolvent kurzu se stává embryologem
- povinnost absolvovat AKK kurz se nevztahuje na absolventy Lékařských fakult! (lékařské
zdravotnické povolání zák. 94/2004Sb.)
- dle dálky praxe junior embryolog - senior embryolog
- povýšení ovlivňuje i ziskání zahraničních vzdělavacích certifikátů
(např. certifikát clinical embryologist/senior clinical embryologist ESHRE)
- atestace => klinický embryolog
- délka praxe + logbook + teoretické znalosti
- minimálně 1 pracovník laboratoře (vedoucího a nebo zástupce)
- organizuje Subkatedra klinické embryologie IPVZ
(Instutut Postgraduálního Vzdělávání ve Zdravotnictví)
 Embryologický laborant
- embryolog/androlog v zácviku (ang. trainee) před absolvování kurzu AKK)
- případně SŠ s dlouholetou praxí
- pomocné práce pod dozorem (např. příprava misek, roztoků, sterilizace,
udržování skladových zásob, ukládání vzorků do kryobanky,...)
prof. Pavel Trávník
Organizace IVF kliniky
 Lékařský genetik
- lékař s atestací v oboru Lékařská genetika (min. 5 let praxe)
- konzultace pacienta nebo dárce/dárkyně
- osobní a rodinná anamnéza
- hodnocení genetického vyšetření (genetika páru, PGT)
 Genetická laboratoř
- odborní pracovníci absolventi VŠ přírodovědného směru
+ SŠ laboratorní technik
- specializovaná genetická analýza (krev, biopsie)
- in-house x společná laboratoř pro více klinik
 Urolog
- lékař s atestací v oboru urologie
- spolupracující ordinace nebo docházející lékař
- řešení urologických problémů mužů (infekce, chirurgie)
- mikrochirurgický odběr spermií
 Imunolog/imunologická laboratoř
- spolupracující atestovaný lékař/laboratoř
- diagnostika imunologických poruch plodnosti
Organizace IVF kliniky
 Psycholog (příp. „fertility coach“)
- Psychologická podpora pacientů (případně i zaměstnanců)
- Interní zaměstanec nebo externí spolupráce
 Provozní oddělení
- personalistika
- účetnictví
- ekonomie
- administrativa
- kontrola kvality
- archivař
- recepční
- IT podpora,..
 Logistické firmy (medical couriers)
- vnitrostátní a mezinárodní trasport
mražených vzorků (gamety/embrya)
- v rámci kliniky/konsorcia neo externí
Hodnocení úspěšnosti
 Fertilization Rate (FR) = počet oplozených oocytů (2PN embrya D1)/počet
oplozovaných oocytů
 Blastulation Rate (BR) = počet blastocyst /počet oplozovaných oocytů
 Utilization Rate (UR) = počet transferovaných + mražených embryí /počet
oplozovaných oocytů
 Survival Rate (SR) = počet úspěšně rozmražených (a viabilních) embryí(nebo
oocytů)/počet rozmražovaných embryí (nebo oocytů)
 Implantation Rate (IR) = počet přenášených embryí/počet implantovaných embryí
 Pregnancy Rate (PR) = počet přenosů/počet biochemických těhotenství (hCG
detekce)
 Clinical Pregnancy Rate (CPR) = počet přenosů/počet klinických těhotenství (detekce
gestačního váčku a/nebo akce srdeční plodu- ASP)
 Ongoing Clinical Pregnancy Rate (oCPR) = počet přenosů/počet pokračujících
klinických těhotenství (těhotenství po 12.týdnu)
 Live Birth Rate (LBR) = počet přenosů/počet živě narozených dětí
 Cumulative Live Birth Rate (CLBR) = počet živě narozených dětí/počet léčebných
cyklů
Vzdělávání embryologů
 ESHRE
= European Society for Human Reproduction and Embryology
Cíle:
 Sdružovat odborníky v oblasti embryologie a reprodukční medicíny
 Podporovat výzkum reprodukční biologie
 Zlepšovat a standardizovat klinickou praxi léčby neplodnosti
 Usnadňovat komunikaci mezi vědci, kliniky, pacientskými
organizacemi a veřejností
 Informovat politiky a regulační autority v Evropě o problematice
asistované reprodukce
- nezisková mezinárodní profesní organizace
- založeno 1985 (R. Edwards and J. Cohen)
- sídlo v Bruselu
- volený předseda, výkonný výbor, výbor národních zástupců,..
- ~7500 členů z 110 zemí
Vzdělávání embryologů
 ESHRE
Speciální zájmové skupiny
Special Interest Groups – SIGs
Vzdělávání embryologů
 ESHRE
 Annual meeting
 Odborné časopisy
 Journal clubs
 Výzkumný grant
 Research Fellowships
 Odborná doporučení
(guidelines )
Vzdělávání embryologů
 ESHRE
 Profesní certifikace
 Certifikace pracoviště
- doklad praxe (logbook)
- test teoretických znalostí
2 úrovně:
- Clinical Embryologist (min 3 roky praxe)
- Senior Clinical Embryologist (min 6 let praxe)
Vzdělávání embryologů
 ESHRE
 Campus Events
- úzce zamřené semináře
 eCampus
- e-learningová platforma
- kurzy, webinary, postery
 Atlas of human embryology
 Aplikace Focus on Reproduction
+
Vzdělávání embryologů
 The International IVF initiative
- live semináře a videa
- Zdarma!
 American Society for Reproductive Medicine
(ASRM)
- odborné akce + společné meetingy s ESHRE
- odkazy na webináře na stránkách
 IVF.net
 Semináře ARE
 Sympozium Asistované Reprodukce
 Facebook/Embryologové