PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKA (PND) invazivní metody zpracovala Mgr. Navaříková ve spolupráci s RNDr. Makaturovou vytvořilo CMBG FN Brno [USEMAP] INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY - biopsie choriových klků (CVS) – chorion villi sampling - odběr plodové vody (AMC) - amniocentesis - odběr krve plodu (CC) – cordocentesis (PUBS) – percutaneous umbilical blood sampling (umbilical vein sampling, umbilical cord blood sampling, fetal blood sampling) -odběr buněk trofoblastu pronikajících do cervikálního kanálu (TRIC) - Trophoblast Retrieval and Isolation from the Cervix -odběr tkáně plodu z abortu [USEMAP] Klinické indikace k prenatálnímu stanovení karyotypu invazivními diagnostickými metodami • • • invazivní metody vyšetření karyotypu plodu jsou indikovány při vyšším riziku narození dítěte s VCA (vrozenou chromosomovou abnormalitou) - hodnoty biochemických markerů mimo normu (screening I., II. trimestru) - věková indikace (v kombinaci s dalšími rizikovými faktory) věk matky – 35-37 let v roce porodu věk otce – nad 40 let (riziko vyššího výskytu monogenních chorob) součet věku rodičů – nad 70 let - VVV nalezené na UZ - balancovaná VCA u rodičů - výskyt VCA v rodině - předchozí porod dítěte s VCA [USEMAP] Riziko Downova syndromu v souvislosti s věkem matky Zvyšování rizika narození plodu s Downovým syndromem v souvislosti s věkem matky (Hájek Z. a kol. 2014) [USEMAP] INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY – postup vyšetření Základním vyšetřením při PND jakékoliv indikace je vyšetření nebalancovaných chromosomových (genomových) aberací, které nejčastěji vznikají de novo a většinou mají závažný klinický obraz. Základní vyšetření: 1.– QF- PCR zaměřená na STR polymorfismy (Short Tandem Repeats) Stanovení počtu chromosomů 13, 18, 21, X, Y, (případně 15, 16, 22, kde je souvislost se samovolnými aborty). Porovnáním DNA profilů plodu a matky lze odhalit i přítomnost maternální kontaminace v odebraném materiálu plodu. Toto vyšetření je indikováno při pozitivním výsledku screeningu na časté aneuploidie nebo při suspektním UZ nálezu. Výsledek do 1 – 2 pracovních dnů. 2.- Celogenomová chromosomová mikroarray (Chromosomal Microarray analysis, CMA). CMA submikroskopické změny počtu kopií úseků na chromosomech – mikrodelece/ mikroduplikace – CNV (Copy Number Variation) s citlivostí 50 – 100 kb. Touto metodou jsou detekovány nebalancované chromosomové abnormality od velkých, viditelných ve světelném mikroskopu až po submikroskopické v souladu s rozlišovací schopností metody. Existují dvě techniky CMA: array-CGH (komparativní genomová hybridizace kontrolní a vyšetřované DNA) a SNP array (kvantitativní genotypizace jednonukleotidových polymorfismů) – metody se doplňují. Klinicky významné CNV jsou prokazovány u 5 – 10% vyšetřovaných plodů s mnohočetnými vadami a normálním karyotypem. Nález potenciálně klinicky významné CNV by měl být verifikován u rodičů stejnou technikou nebo jinými metodami. [USEMAP] INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY – postup vyšetření Základní vyšetření: 3.- Při určitých indikacích je doporučeno klasické vyšetření karyotypu plodu (např. při familiární translokaci nebo verifikaci nálezu jinou metodou.) 4.- Sekvenování nové generace (NGS), prenatální vyšetření exomu (WES) – vyšetření v indikovaných případech Cílená vyšetření: Výběr konkrétních vyšetřovacích metod určuje klinický genetik. [USEMAP] ODBĚR PLODOVÉ VODY • • • 1) odběr plodové vody (amniocentéza, AMC) – klasická 16.- 20. t.g. (punkce amniální tekutiny pod kontrolou UZ) 16-20 ml - INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY AMC jsou analyzovány amniocyty (kožní fibroblasty, epiteloidní a fibroepiteloidní buňky) odloučené přímo z těla plodu (buňky plodu) počet odebraných ml by měl odpovídat týdnu gravidity [USEMAP] PLODOVÁ VODA • • • 1) odběr plodové vody (PV) - amniocentéza, AMC funkce plodové vody: - prostředí pro pohyb plodu - ochrana před vlivy zevního prostředí (nárazy, tlaky, zvuky) - reguluje teplotu plodu - polykání PV, vylučování moči – příprava trávicí soustavy na fungování po porodu - zdroj informací o plodu složení plodové vody: - je nažloutlá, při přenášení i nazelenalá - 99% voda - organické i anorganické látky – např. glukóza, bílkoviny, močovina, kreatinin, minerální látky, buňky kůže a gastrointestinálního traktu plodu INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY [USEMAP] ODBĚR CHORIOVÝCH KLKŮ • • • 2) biopsie choriových klků (chorionic villi sampling, CVS) – 11. – 14.t.g. INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY cvs klky4 [USEMAP] CHORIOVÉ KLKY • • • 2) biopsie choriových klků (chorionic villi sampling, CVS) – extraembryonální tkáň chorion – vnější obal kolem celého embrya, který se zvrásňuje do podoby klků, odběr choriových klků se provádí v místě spojení chorionu s placentou INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY E10a E11b [USEMAP] CHORIOVÉ KLKY INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY 2) biopsie choriových klků (chorionic villi sampling, CVS) 17136DCB skládá se ze syncitia + cytotrofoblastu = povrchová vrstva buněk v blastocystě ve vývojové fázi blastocysty dochází k přichycení embrya k epitelu endometriální sliznice dělohy povrchová vrstva buněk v blastocystě = trofoblast chorion vzniká z trofoblastu [USEMAP] klky ve zkumavce CHORIOVÉ KLKY INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY 2) biopsie choriových klků (chorionic villi sampling, CVS) funkce choriových klků – placenta vzniká ze stěny děložní sliznice zanořením choriových klků do děložní sliznice - choriové klky zvyšují povrch plodového obalu chorionu, umožňují příjem výživných látek z matčiny krve vrůstání klků do děložní stěny klky připomínají paroží vysoké zvěře [USEMAP] ODBĚR KRVE PLODU • • • 3) odběr krve plodu z pupečníku pod kontrolou UZ (kordocentéza, CC) – po 20. t.g. – časová tíseň, ověření přítomnosti infekce (CMV – cytomegalovirus) - INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY CC [USEMAP] Prenatální molekulárně genetické vyšetření • • • QF- PCR z DNA plodové vody nebo choriových klků (Quantitative fluorescent polymerase chain reaction) - výsledek 24 – 48 hodin - kvantitativní fluorescenční PCR - rychlá diagnostika nejčastějších aneuploidií autosomů a gonosomů – 21, 18, 13, X, Y, případně dalších souvisejících se SA (15, 16, 22) - STR (Short Tandem Repeats) mikrosatelitní markery v intronech genů (2-6 bp, opakování 2 – 100x) na chromosomech, je analyzováno více STR markerů pro každý chromosom - jedinci a alely různých genů se liší v počtu opakování STR - délka fragmentu závisí na počtu STR opakování, množství produktu na množství templátové DNA – 2, 3 chromosomy, 1 chromosom - PCR trvá až 4 hodiny, fluorescenčně značené primery – kapilární elektroforéza - případnou kontaminaci krví matky lze touto metodou rozpoznat INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY [USEMAP] MOLEKULÁRNĚ CYTOGENETICKÉ PRENATÁLNÍ VYŠETŘENÍ array- CGH (Komparativní genomová hybridizace na čipu) Výsledek do 3 dní array – CGH – DNA čipy odhalí nebalancovaný genetický materiál - odhalí o 5,2% patologických nálezů více než klasická cytogenetika - DNA pacienta se hybridizuje na sklíčko, na kt. jsou naspotovány sondy o známé sekvenci – odhalí nebalancovaný genet. materiál na všech chromosomech - detekce malých změn - z AMC a CVS bez kultivace, tkáň potracených plodů (izolace DNA) - potíže s interpretací nálezů – ne všechny souvisejí s postižením (polymorfismy bez fenotypového projevu - Copy Number Variation), nutné ověření nálezu u rodičů, ev. genotypovo-fenotypová korelace Nelze zachytit – balancované přestavby - polyploidie - malé mozaiky menší než 10, 20% - bodové mutace INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY [USEMAP] Stanovení karyotypu plodu (ověření přítomnosti / nepřítomnosti VCA) • • • délka kultivace plodové vody a choriových klků je přibližně 10 dnů délka kultivace krve plodu z pupečníku je 72 hodin (jako u periferní krve) STANOVENÍ KARYOTYPU (metodami klasické cytogenetiky) + následné potvrzení patologických nálezů metodou FISH (molekulární cytogenetika) INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY dlouhý2 norm mužský Zemna tel 11 [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika • • • AMC – odběr plodové vody – přítomnost pravého mozaicismu u plodu (v těle plodu jsou přítomny 2 nebo více buněčných linií, jejichž karyotyp je odlišný) např. 47,XX,+21 [10] / 46,XX [20] – riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu (kultivační artefakt) (např. přítomnost nadbytečného chromosomu nebo strukturní přestavby v 1 mitóze) vyloučení kultivačního artefaktu - kultivace 2 paralelních kultur z AMC - opakovaný odběr (AMC, CVS) - riziko kontaminace mateřskou krví při odběru - po kultivaci nemohou buňky mateřské krve ovlivnit výsledek karyotypu plodu, protože buňky mateřské krve se nenakultivují v médiu specifickém pro fibroblasty z kůže a sliznic plodu (amniocyty), (ale mohou ovlivnit výsledek analýzy metodou PCR – izolovaná DNA je směsí DNA kožních fibroblastů plodu a krevních buněk matky, proto při tomto typu vyšetření zařazujeme DNA matky jako jeden z kontrolních vzorků) - riziko kontaminace mateřskou tkání při odběru – při používané technice odběru je minimální riziko kontaminace vzorku mateřskou tkání a kultivační médium je specifické pro amniocyty. Riziko, že nakultivujeme spolu s tkání plodu i tkáň matky je minimální. - paralelně se stanovením karyotypu provádíme vyšetření QF-PCR mozaicismus - přítomnost 2 nebo více buněčných linií ve vyšetřované tkáni, které se liší karyotypem - NE VŽDY SE JEDNÁ O PRAVÝ MOZAICISMUS INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY analýza buněk plodu [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika - riziko vzniku pseudomozaiky kultivačního původu hrozí u dlouhodobě kultivovaných vzorků (za dlouhodobou je považována délka kultivace +/- 10 dnů) - v dnešní době paralelně s vyšetřením karyotypu choriových klků vždy provádíme QF-PCR. Při tomto vyšetření srovnáváme výsledky z DNA choriových klků s DNA matky pro odhalení případné kontaminace mateřskou krví či tkání. - při dlouhodobé kultivaci existuje riziko vzniku pseudomozaiky způsobené kontaminací mateřskou tkání (pouze u plodů ženského pohlaví, plod má stejné gonosomy jako matka, neodlišíme mitózy od matky a plodu) – prevence – pečlivé oddělení mateřské tkáně před kultivací - kontaminace mateřskou krví pro cytogenetické vyšetření nevadí (buňky krve se nenakultivují za podmínek kultivace choriových klků); pro molekulárně genetické vyšetření je kontaminace krví matky na závadu – izolujeme DNA současně z krve i klků – směs DNA plodu a matky. ) INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY CVS - biopsie choriových klků (chorionic villi sampling) analýza extraembryonální tkáně (plodový obal chorion) [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY (VCA) MOZAICISMUS – prenatální diagnostika • • • – je možný rozdílný nález karyotypu embrya a extraembryonální tkáně - riziko, že placenta má normální karyotyp a plod trisomii je minimální - sporné nálezy jsou potvrzovány AMC placentární mozaicismus – možný zdroj falešně pozitivních výsledků klky Přibližně 2% vyšetření vzorků z CVS přinášejí nejednoznačný výsledek v důsledku chromosomového mozaicismu (zahrnuje pravý mozaicismus a pseudomozaicismus). V těchto případech je pro potvrzení případné chromosomové aberace doporučeno indikovat AMC. pravý mozaicismus – rozdílný karyotyp u embrya a v extraembryonální tkáni choriových klků (kromě toho jak u plodu, tak v klcích, může být karyotyp s pravou mozaikou nebo bez mozaiky) [USEMAP] METODY INVAZIVNÍ PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY rizika invazivních metod: - odtok PV po AMC - klasická AMC, CVS, CC – 0,3 - 0,5% riziko odtoku PV a abortu (u abortu do 2 týdnů po odběru je uvažováno o souvislosti s AMC, CVS, CC) klasická cytogenetika – délka trvání vyšetření: AMC - výsledek za 2 -3 týdny CVS – 2 – 3 týdny (dlouhodobá kultivace) CC – výsledek do týdne molekulární genetika – délka trvání vyšetření: QF-PCR – za 24 – 48 hodin Hodnoty rizika jsou orientační: - zkušenost lékaře odebírajícího materiál - míra sledování zdravotního stavu těhotné a plodu (včasným podchycením případných komplikací lze předejít abortu) INVAZIVNÍ METODY PRENATÁLNÍ DIAGNOSTIKY [USEMAP] FETÁLNÍ TERAPIE není běžným postupem v souvislosti s dědičnými chorobami plodu [USEMAP] UPT (umělé přerušení těhotenství) z genetické indikace • • • Ukončení gravidity pro VVV z genetické indikace je možné do 24. t.g. - interrupce – do 12.t.g. - indukce abortu později - - Pozdní záchyt VV (po 24. t.g.) – mezioborová komise – gynekolog, odborný lékař (vada plodu), genetik, psycholog – ve výjimečných případech UPT i později - individuální poradenství [USEMAP] VROZENÉ CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY U PLODU [USEMAP] Zastoupení chromosomových změn plodů [USEMAP] CHROMOSOMOVÉ ABNORMALITY •vrozené chromosomové abnormality (VCA) – viz prezentace „vrozené chromosomové abnormality“ • vyšetření konstitučního karyotypu – početní • - strukturní Kterákoli abnormalita může být přítomna i v mozaice, ale prenatální záchyt mozaiek není příliš častý. [USEMAP] PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÉ TESTOVÁNÍ embryí (asistovaná reprodukce) PGT-A: preimplantační genetické testování aneuploidií (dříve PGS – preimplantační genetický screening) PGT-M: preimplantační genetické testování monogenních chorob (dříve PGD – preimplantační genetická diagnostika) PGT-SR: preimplantační genetické testování strukturních chromosomových přestaveb (structural rearrangement) (dříve PGD – preimplantační genetická diagnostika) PGT-A: array-CGH, MPS (masivně paralelní sekvenování) PGT-M: MPS PGT-SR: MPS, SNP array (Karyomapping) Karyomapping – metoda umožňuje nepřímou DNA diagnostiku pro všechny lokusy lidského genomu. Podstatou je propojení SNP markerů s hledanou mutací. Lze detekovat aneuploidie i mutace v genu. Porovnáváme SNP profily rodičů a embrya. [USEMAP] PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÉ TESTOVÁNÍ embryí (asistovaná reprodukce) - analýza několika buněk 5 - 6 denního embrya = blastocysty (odběr trofektodermu), v některých případech odběr buněk (blastomer) z 3 denního embrya - možnost detekce genetických abnormalit embrya – aneuploidie chromosomů, detekce nebalancovaného genetického materiálu u embryí nosičů balancované přestavby, analýza mutací v genech (monogenní choroby) - do dělohy matky je implantováno embryo bez genetické zátěže - zvýšení pravděpodobnosti úspěšného těhotenství a narození zdravého dítěte - vyšetření je možné doplnit vyšetřením z plodové vody - není vyloučena jiná genetická vada než ta, která je vyšetřena [USEMAP] ee1 [USEMAP] ee2 [USEMAP] ee3 [USEMAP] ee4 [USEMAP] ee6 [USEMAP] Obsah prezentace je v souladu s aktuálními doporučeními Společnosti lékařské genetiky a genomiky ČLS JEP (www.slg.cz) Kontakt pro dotazy: Navarikova.Marta@fnbrno.cz