Žlutý kopec 7, 656 53 Brno
www.mou.cz
T
@
Poskytovatel zdravotních služeb akreditovaný Organizací
evropských onkologických ústavů (OECI) a Českou
společností pro akreditaci ve zdravotnictví.
Průtoková cytometrie
Andrea Wagnerová
+420 543 136 704
andrea.wagnerova@mou.cz
2
Průtoková cytometrie
Laboratorní metoda, která umožňuje rychlou multiparametrickou analýzu buněk.
U každé buňky z připravené buněčné suspenze je možné analyzovat:
 velikost buňky
 vnitřní strukturu buňky (granularita)
 detekovat tzv. CD znaky (intracelulární x extracelulární)
Význam průtokové cytometrie spočívá zejména v tzv. imunofenotypizaci buněk, tj.
možnosti detekovat antigeny buněk (CD znaky).
3
Princip průtokové cytometrie
Pomocí průtokového cytometru je možné buňky identifikovat a kvantifikovat.
Buněčná suspenze je unášena proudem nosné kapaliny → s paprskem světla
dochází na buňkách k rozptylu světla v různých úhlech → rozlišení vlastnosti buněk:
 Forward scatter (přímý rozptyl) – rozptyl laserového paprsku v malém úhlu,
informace o velikosti částice,
 Side scatter (boční rozptyl) – rozptyl laserového paprsku pod úhlem 90 °,
informace o komplexitě částice.
Součástí buněčné suspenze jsou fluorochromem konjugované monoklonální
protilátky, které se vážou na konkrétní struktury částice a po setkání s laserovým
paprskem dochází k excitaci fluorochromu a následné emisi záření. Emitované
fluorescenční záření je v přístroji detekováno a zpracováno.
4
Průtokový cytometr
Průtokový cytometr tvoří 3 základní systémy: fluidní, optický a elektronický.
Fluidní systém (Rahman 2016)
5
Instrumentace
Fluidní systém: je tvořený centrálním kanálem, kterým pod tlakem prochází nosná
kapalina → usměrnění částic (hydrodynamická fokusace).
Fluidní systém (Rahman 2016)
6
Instrumentace
Optický systém:
 lasery (zdroj světla),
 systém čoček – soustřeďují fotony emitovaného záření na sadu zrcadel a filtrů,
 zrcadla a optické filtry – usměrňují a odrážejí světlo různých vlnových délek do
konkrétních fluorescenčních kanálů.
Fluorochrom navázaný na monoklonální/polyklonální protilátce → vazba na buňky
→ projití buňky laserovým paprskem → excitace → emise fotonů → detekce
optickým systémem přístroje.
7
Instrumentace
Detekční systém: je představován detektory, které převádějí světelný signál na
elektrický. Počet detektorů se liší v závislosti na typu průtokového cytometru.
2 typy detektorů:
 fotodiody – pro detekci silnějšího signálu,
 fotonásobiče – jsou citlivějšími detektory vhodnými pro detekci emitovaného
fluorescenčního záření.
Výsledkem je grafické zobrazení na obrazovce počítače.
8
Analýza dat
Analýza dat je prováděna pomocí grafických a číselných údajů. Pomocí tzv. gatování
lze oddělit jednotlivé populace buněk.
Grafický výstup:
jednoparametrový histogram dvouparametrový scattergram
9
Přímá imunofluorescence
Antigen (CD znak) → protilátka značená fluorochromem → komplex Ag x Ab →
molekula fluorescenčního barviva emituje záření o specifické vlnové délce →
detekce detektorem.
Populace CD3+ buněk, tj. T-lymfocyty
(osa x znak CD3, použitým
fluorochromem je APC750).
10
CD klasifikace
Tabulka 1: Přehled nejznámějších povrchových antigenů
CD znak Výskyt
CD3 T lymfocyt
CD3, CD4 Th lymfocyt
CD3, CD8 Tc lymfocyt
CD19 B lymfocyt
CD14 Monocyt
CD15 Neutrofilní, eozinofilní granulocyt
11
Fluorochromy
Tabulka 2: Přehled vybraných fluorochromů (Beckman Coulter)
Použitím monoklonálních protilátek značených různými fluorochromy je možné
během jedné analýzy detekovat na buňkách více antigenů.
Fluorochrom Excitace (nm) Emisní vrchol (nm)
FITC 488 525
KrO 405 528
PB 405 455
PC7 486–580 710–800
APC 633–638 660
PE 488 575
12
Aplikace průtokové cytometrie
 Imunofenotypizace lymfocytů
 Funkční testy a testy fagocytózy
 Měření obsahu DNA v buňkách (hodnocení ploidie, buněčného cyklu)
 Stanovení cytokinů
 Imunofenotypizace trombocytů, erytrocytů
13
Vyšetřovaný materiál
K nejčastěji vyšetřovanému biologickému materiálu patří:
 periferní krev,
 kostní dřeň,
 buněčná suspenze získaná z bioptického vzorku (vzorku tkáně), uzliny,
 jiné tělní tekutiny (likvor, výpotky, BAL…).
14
Příprava vzorku
Ab + biologický materiál
Inkubace 15 min ve tmě při lab. teplotě
Lyzační roztok (lýza ery)
Inkubace 15 min ve tmě při lab. teplotě
Promytí vzorku (odstranění nenavázaných Ab a odpadu po lýze ery)
Měření (v řádu minut)
15
Cytometrický výstup měření
Měření nám umožní vizualizaci různých parametrů, jejich grafické znázornění:
 histogram (1 parametr; počet buněk x analyzovaný parametr)
 dot plot (2 parametry → jeden na ose x, druhý na ose y)
histogram dot plot
16
Cytometrický výstup měření: čtení grafů
Buňky jsou zobrazeny jako tečky v příslušné oblasti.
 na ose y stoupá pozitivita směrem nahoru,
 na ose x stoupá pozitivita směrem doprava
17
Imunofenotypizace
Detekce antigenů na povrchu či uvnitř analyzovaných buněk pomocí fluorochromem
značených monoklonálních protilátek.
Součást laboratorních diagnostických postupů:
 přítomnosti klonu maligních buněk hematopoetického původu,
 liniová příslušnost buněk,
 stupeň diferenciace.
Příklady onemocnění, využití pro diagnostiku:
 akutní a chronická leukémie,
 PNH,
 mnohočetný myelom…
18
Funkční testy
Detekce antigenů na povrchu analyzovaných buněk po jejich aktivaci pomocí
fluorochromem značených monoklonálních protilátek.
Cílem provedení funkčních testů je:
 odhalení poruchy ve fungování leukocytů,
 schopnosti jejich aktivace.
19
Funkční testy: rozdělení
Funkční testy lymfocytů:
 aktivitu T lymfocytů,
 aktivitu B lymfocytů,
 aktivitu NK buněk.
Funkční testy granulocytů:
 aktivita neutrofilních granulocytů (fagocytóza, tzv. burst test),
 aktivita bazofilních granulocytů (alergie, tzv. bazotest).
20
Funkční testy lymfocytů
Aktivita lymfocytů se stanovuje na základě schopnosti buňky:
 proliferovat,
 exprimovat aktivační molekuly,
 produkovat cytokiny.
21
Funkční testy: exprese aktivačních molekul
Stanovení exprese antigenů na aktivovaných buňkách po kultivaci s mitogenem.
Konkrétní molekuly se vyskytují jen na aktivovaných buňkách, varianty provedení
testu:
 Časná aktivace po 24 hod kultivace s mitogenem
 T, B lymfocyty exprimují po aktivaci CD69
 Pozdní aktivace po 48 hod kultivace s mitogenem
 T lymfocyty exprimují po aktivaci CD25
 B lymfocyty exprimují po aktivaci CD23
22
Průtoková cytometrie: videoukázka
Průtoková cytometrie: video
23
Zdroje
Beckman Coulter – Instruction For Use [online]. Poslední revize 30. 9. 2021 [cit,
2022-03-10]. Dostupné z: https://www.mybeckman.cz/search#q=navios&t=coveo-
tab-techdocs
Ormerod MG. Flow Cytometry: A Practical Approach. Third Edition. Oxford; 2000.
Žlutý kopec 7, 656 53 Brno
www.mou.cz
Děkuji za pozornost.
RNDr. Andrea Wagnerová