DIAGNOSTIKA RNA DNA PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ analýza mikrosatelitů SCORING •Restrikční analýza PCR produktu •Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy •detekce variant pomocí sond •ARMS •MLPA •Triplet Primed PCR • SCANNING •analýza teploty tání (SYBR Green) •sekvenování EXPRESE SESTŘIH „SEKV. EXONŮ“ • Detekce infekčních agens • •Přímá RNA diagnostika - screenování celé kódující oblasti příslušného genu (eliminace intronů, poskytuje informace o alternativním sestřihu) • •Analýza genové exprese: – diferenciační diagnostika některých typů nádorů (NB) – detekce cirkulujících nádorových buněk v krvi, kostní dřeni pacienta – monitorování průběhu léčby a detekce reziduální choroby – kontrola štěpu před autologní transplantací – RNA v diagnostice RNA savčí buňka: • 10 - 30 pg celkové RNA • rRNA (28S,18S, 5S) 80-85% • tRNA, snRNA 15-20% • mRNA 1-2% 360 000 mRNA molekul/buňku , tj. 12 000 rozdílných transkriptů typická délka 1 transkriptu cca 2kb • • Izolace RNA Pro selektivní izolaci mRNA se využívá zejména její polyadenylace (sekvence An n ~ 10 – 200, ozn. polyA) na jejím 3` konci. •použití pevného nosiče, na který je kovalentně navázán oligonukleotid polyT, jehož délka se pohybuje v rozmezí 10 – 20 nukleotidů. •dojde k hybridizaci mRNA k polyT na nosiči pomocí sekvence polyA. •po odmytí nenavázaných RNA jsou hybridizačně navázané molekuly mRNA eluovány pomocí zvýšení teploty nebo iontové síly. • přítomnost ribonukleáz (RNázy) v buňce • RNázy – velmi stabilní – nevyžadují kofaktory – účinné v nízkých koncentracích – obtížná inaktivace – kontaminace RNázami : lidská pokožka prachové částice (bakterie,plísně) • izolace a analýza RNA : speciální přístup i techniky Nestabilita RNA • komplikace během odběru a zpracování biologického vzorku: – v okamžiku odběru RNA se stává extrémě nestabilní – dva hlavní typy artefaktů: 1) redukce specifických i nespecifických druhů mRNA (downregulace genů a enzymatická degradace RNA) 2) indukce exprese určitých genů stabilizace RNA ve vzorku při odběru : - okamžité zmrazení v tekutém dusíku a uložit při -80°C - stabilizační roztoky: RNAlater (tkáně), RNAprotect (bakterie), PAXgene (krev, kostní dřeň) Analyzovaná RNA musí reprezentovat in vivo expresi a sekvenci vzorku •kontaminace DNA – PCR primery překrývající hranici intron/exon – štěpení DNázami – cílená izolace mRNA • izolovaná RNA může být uložena při -20 nebo -70°C (bez degradace RNA po 1 roce uložení) Stabilizace RNA a uložení isothiokyanát (inhibitor RNáz) 1970 David Baltimore, Howard Temin a Satoschi Muzitani Reverzní transkripce David_Baltimore_NIH David Baltimore in the 1970’s. Image via the National Library of Medicine (image in public domain). https://norkinvirology.files.wordpress.com/2013/12/temin.jpg Howard Temin in the 1970’s. Image via via Nobelprize.org. Nobel Media AB 2013 Reverzní transkriptáza (RT) RNA-dependentní DNA-polymeráza katalyzuje transkripci jednovláknové RNA (ssRNA) do jednovláknové DNA (ssDNA) patří do skupiny enzymů s polymerázovou aktivitou 1970 David Baltimore, Howard Temin a Satoschi Muzitani Reverzní transkripce Retrosvět Rozmanitá kolekce sekvencí DNA vytvářených reverzní transkripcí http://www.wikiskripta.eu/images/thumb/e/e0/Sch%C3%A9ma_exprese_virov%C3%BDch_genom%C5%AF_5.png/300 px-Sch%C3%A9ma_exprese_virov%C3%BDch_genom%C5%AF_5.png Reverzní transkripce Používají se tři typy primerů: •specifické oligonukleotidy pro syntézu vybrané určité mRNA •směs náhodných hexanukleotidů •oligo(dT) oligo(dT)20 homogenní mix 20-mer thymidinů oligo(dT)12–18 mix od12-mer do 18-mer thymidinů . M-MuLV Moloneyho myší leukemický virus do 10 kb 37°C AMV ptačí myeloblastický virus do 10 kb 42°C Tth bbakteriální termostabilní polymerasa do 2 kb 65°C nemá aktivitu RNasy H, vyžaduje Mn +2 kationty v reakci Reverzní transkriptázy Reverzní transkripce http://stary.lf2.cuni.cz/projekty/prusa-dna/pic/scan/pc22.gif https://tools.thermofisher.com/content/sfs/gallery/high/Anchored-Oligo-dT.jpg Priming strategie pro cDNA syntézu Kombinace oligo dT a random hexamer generuje více sensitivní a účinné RT-qPCR reakce. Přímá RNA diagnostika RNA A A A A A A A T T T T T T T T T T T T T T cDNA PCR RT-PCR T T T T T T T primer oligo(dT) genově specifický primer Extrakce RNA Přímá DNA/RNA diagnostika sekvenace cDNA sekvenace DNA MLPA nález sekvenční změny (substituce, delece, inzerce) nález rozsáhlé delece negativní výsledek vzorek tkáně / periferní krve izolace RNA izolace DNA RT-PCR negativní výsledek RNA-antisense decay ??? Varianta způsobující poruchu sestřihu ??? Varianta v intonu způsobující poruchu sestřihu, delece jednoho a více exonů ??? synonymní varianta • •jednodušší a rychlejší skríning multiexonického genu (10 segmentů cDNA místo 60 exonů), mRNA je bez intronů • •záchyt sestřihových mutací v intronech •záchyt synonymních variant způsobujících poruchu sestřihu • •záchyt delece celého exonu na jedné alele genu • •nižší ekonomické náklady • •složitější odběr krve pro izolaci RNA • •nižší stabilita RNA • •dlouhé úseky genu obtížnější elektroforetická separace a sekvenace • •RNA-antisense decay • • Výhody a nevýhody RNA diagnostiky genů Výhody a nevýhody RNA diagnostiky genů •Analýza DNA • •GTG>GTA •c.2709G>A •p.V903V Analýza cDNA c. 2707_2850del p.V903-Q950del48 Splice error GTA RNA-antisense decay • RNAi mechanism Antisense RNA mechanism Výhody a nevýhody RNA diagnostiky genů Retinoblastom – metodou Sangerovo sekvenování RB1 gen: p.[R255X]+[=], c. [763C>T]+[=] DNA izolovaná z krve cDNA izolovaná z krve • DNA Retinoblastom metodou 4-5-4 sekvenování 1608 DNA izolovaná z krve • cDNA Retinoblastom metodou 4-5-4 sekvenování c391 stop cDNA izolovaná z krve Neurofibromatoza typu 1 von Recklinhausen disease NF1 příznaky Skvrny bílé kávy Nejčastější projevem NF1 je vznik mnoha bezbolestných, světle hnědých skvrn na kůži, které jsou známy pod názvem “café au lait spots” a které postihují 95% pacientů s NF1. Tyto skvrny mohou být přítomné již po porodu, nebo se objeví v průběhu prvních tří let života. Během dětství se u většiny dětí s NF1 vyskytne alespoň šest těchto flíčků o velikosti cca 5 mm. Během dospívání dané skvrny rostou a v dospělosti u většiny pacientů dosahují okolo 15 mm. http://www.neurofibromatoza.cz/wp-content/uploads/2012/06/kavove-skrvny-150x150.jpg Pihy Dalším obvyklým příznakem NF1 je seskupení pih na neobvyklých místech jako je např. podpaží, ve slabinách či pod prsy. NF1 příznaky Nezhoubné nádory na kůži nebo pod kůží – neurofibromy S příbývajícím věkem, obvykle poté v době dospívání či na počátku dospělosti, se osobám s NF1 vytvoří neurofibormy, což jsou nezhoubné nádory rostoucí na povrchu nervových tkání pod kůží. V době dětství nabývají velikost hrášku, avšak s přibývajícím věkem se zvětšují. Počet neurofibromů se u každé osoby liší. Někteří jich mají na těle pouze několik, kdežto jiným pokrývají celé tělo. Většina neurofibromů není bolestivá, avšak jejich vzhled se může jevit jako neatraktivní; mohou se zachytit na oblečení a občas také mohou způsobit podráždění či štíplavý pocit. U některých osob mohou způsobovat rozlehlá bolestivá opuchnutí. V nejhorších případech dochází poblíž jejich výskytu k poškození kostí http://www.neurofibromatoza.cz/wp-content/uploads/2012/06/neurofibromy-150x150.jpg NF1 příznaky Oči Okolo 14% dětí s NF1 se vyvine nádor uvnitř optického nervu – tzv. gliom optiku. Tento nádor bývá obvykle nezhoubný. Úkolem gliom optiku, optického nervu umístěného v pozadí každého oka, je odesílání informací z očí do mozku. Nejvější výskyt tohoto typu nádoru je u dětí ve věku sedmi let. Mnohé z těchto nádorů jsou malé, vyznačují se pomalým růstem a nezpůsobují žádné problémy. Nicméně u dětí s rychle rostoucím nádorem se brzy mohou objevit potíže se zrakem. Dalším frekventovaným příznakem jsou malé hnědé skvrny na duhovkách, jež se označují jako Lisch uzliny. Ve většině případů nezpůsobují žádné potíže se zrakem, ani jiné nepříjemnosti. http://www.neurofibromatoza.cz/wp-content/uploads/2012/06/lisch-nodules-150x150.jpg http://www.neurofibromatoza.cz/wp-content/uploads/2012/06/nador-oci.jpg NF1 příznaky Mozek a nervový systém Příznaky postihující mozek a nervový systém jsou u osob s NF1 poměrně běžné. Cca 20% osob trpí migrénami, u 5% se objeví mozkový nádor. Tyto nádory jsou zpravidla malé, nezhoubné a nezpůsobují žádné viditelné symptomy. Výjimkou jsou však nádory, které se občas vyskytnou v určitých částech mozku, a které způsobují příznaky jako jsou: Změny osobnosti Slabost na jedné straně těla Potíže s rovnováhou a koordinací U cca 7% pacientů se vyvine epilepsie s opakovanými záchvaty. Většinou se jedná o mírnou formu epilepsie s nepravidelnými záchvaty. Maligní nádor pochvy periferního nervu (MPNST) MPNST je zřejmě nezávažnějším příznakem u osob s NF1. Jedná se o typ rakoviny, který se objevuje u cca 10% osob s NF1 a to nejčastěji ve věku mezi 20-35 let. Příznaky: Neurofibromy se změní z měkké tkáně na tvrdou Existující neurofibromy se náhle zvětší Konstantní bolest delší než jeden měsíc nebo bolest, která pacienta nutí vstávat Náhlé problémy s nervovým systém, které se u pacienta nevyskytovaly v minulosti: např. slabost, necitlivost či pocit brnění v rukou či nohou Ztráta kontroly močového měchýře či střev Neurofibromatoza typu 1 von Recklinhausen disease NF.png NF.png NF.png Autosomálně dominantní Frekvence 1:3000 Lokus 17q 50% mutací de novo Predispozice k tumorům nervového systému Café-au- lait spots Neurofibromy Lisch nodule NF.bmp Struktura NF1 genu - 350 kb - 60 exonů - 11 - 13 kb mRNA - protein neurofibromin - 2818 aminokyselin - zřejmě tumor supresor Neurofibromatoza typu 1 Molekulární diagnostika Neurofibromatoza typu 1 Molekulární diagnostika Komplikace při molekulární diagnostice NF1 - problematická klinická diagnostika - až 50 % případů de novo - vysoká mutační rychlost - velikost genu (350 kb, 60 exonů) - absence hot spot oblastí - nutnost vyhledávání v celém genu - nejasná korelace mezi typem mutace a formou postižení - neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény - různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci cDNA analýza RT cDNA PCR NF1 cDNA ( 60exonů) P1 P3 P5 P7 P9 P2 P4 P6 P8 P10 (~ 1000 - 1200bp) Sekvenační analýza celková RNA Neurofibromatoza typu 1 Molekulární diagnostika Sekvenace cDNA segmentu P7 NF1 genu (exony 28 -32/33) C >T cDNA NF1 pacienta, mt C5839T ( Arg > STOP) standardní cDNA 5’ 3’ 5’ 3’ Sekvenace DNA segmentu C:\Adobe Albums\labina\ex37NF1.jpg Analýza genové exprese Nádorové buňky se od normálních zdravých buněk liší na molekulární úrovni svým expresním profilem nádorová buňka exprimuje jiné geny ze své výbavy projeví se změnou množství a spektra exprimované mRNA využití metody real-time RT-PCR - studium genové exprese, hledaným znakem epiteliálních nádorových buněk je mRNA. Analýza exprese v onkologii Onkomarkery Nádorové markery jsou látky produkované maligními buňkami, nebo organismem jako odpověď na nádorové bujení. Od látek produkovaných normálními buňkami se liší kvalitativně – normální buňky je neprodukují, či kvantitativně – produkované i normálními buňkami. Klinický význam jednotlivých markerů je i u samotných odborníků, zabývajících se problematikou onkomarkerů značně diskutovaným problémem. I jejich stanoviska se postupem času měnila. Od původního přeceňování až k úplnému zatracení a novému uznání. Verifikace významu onkologických markerů a jejich využití v ambulantní praxi neustále probíhá. Jaký mají onkomarkery klinický význam Statistické pojmy pro klinické hodnocení 1. Cut off – referenční hladina je definována jako hladina markeru, pod kterou leží většina hodnot zdravé populace, či pacientů s benigním onemocněním, nebo hladina pod kterou leží většina hodnot pacientů v kompletní remisi 2. Senzitivita markeru Udává procento správně pozitivních výsledků z daného souboru 3. Specificita markeru Udává procento správně negativních výsledků z daného souboru 4. PV+ pozitivní prediktivní hodnota – udává v procentech s jakou pravděpodobností bude mít pacient hledanou chorobu, bude-li test pozitivní 5.PV - negativní prediktivní hodnota - udává v procentech s jakou pravděpodobností nebude mít pacient hledanou chorobu, bude-li test negativní • je produkován pouze u maligních onemocnění • je orgánově specifický • vyskytuje se ve vysokých koncentracích v biologických tekutinách • hladina koreluje s velikostí nádoru • hladina koreluje se stádiem onemocnění • hladina koreluje s prognózou • hladina koreluje s efektem léčby • umožňuje průkaz zbytkové nádorové tkáně Kritéria ideálního onkomarkeru Rozdělení onkomarkerů podle chemické struktury, nebo biologické funkce • onkofetální antigeny • enzymy • hormony • intracelulární onkomarkery • ostatní blíže nespecifikovatelné látky Onkomarkery: indikace podle orgánů Zvýšení některých onkomarkerů za fyziologických, nebo nemaligních podmínek Podmínka Fyziologicky zvýšené onkomarkery gravidita AFP, hCG, Ca125, TPS, TG menstruační cyklus Ca125 kouření CEA, TPS, TG ethylismus CEA, TPS katetrizace moč. měch. PAP, PSA Podmínka Zvýšení onkomarkerů u jiných chorob Chron. onemocnění jater CEA, TPS, Ca 15-3, Ca 19-9, Ca 125 Endometrióza Ca 125 Pankreatitida Ca 19-9, Ca 125 Hypertrofie prostaty PAP, PSA cukrovka Ca 19-9 Co z toho plyne Nádorové onkomarkery by se měly stanovovat jednou metodou v jediné laboratoři. Hodnoty onkomarkerů mohou být ovlivněny celou řadou procesů. Pro kvalitní zhodnocení je nutná úzká spolupráce laboratoře a klinického pracoviště. ALE… … diagnostický práh onkomarkerů umožňuje v příznivých případech odhalit nádor o hmotnosti 1 mg, tedy asi 106 maligních buněk, zatímco klinická diagnóza bývá určena většinou až u nádoru, který obsahuje nejméně 109 buněk, tedy nádor v průměru 1 cm. Aplikace a využití v onkologické praxi Screening Primární diagnostika Diferenciální diagnostika Staging Sledování účinnosti terapie Hodnocení léčebné odpovědi Sledování průběhu choroby Autologní transplantace při HD chemoterapii Prognóza Predikce Biologický materiál (tkáň tumoru, kostní dřeň, periferní krev) RT- PCR (cDNA) Relativní kvantifikace exprese k housekeeping genu (LightCycler) • Pozitivní exprese markeru (např. TH, TrKC, c-myc…) může upřesnit diagnózu nebo poukáže na remisi/ progresi či na odpovídavost na léčbu. • Odběry chodí opakovaně umožní sledovat minimální reziduální nemoc v čase. Izolace RNA Analýza exprese molekulárních onkomarkerů Kvantifikace absolutní vs. relativní ABSOLUTNÍ RELATIVNÍ •standardní křivka (ředění standardu) •kvantifikace vzorku vzhledem ke standardní křivce • • • • •užití housekeepingových genů •kvantifikace cílového genu vzhledem k housekeepingovému u stejného vzorku → normalizovaný poměr → relativní kvantifikace •∆Ct je konstantní (poměr je vždy stejný) •!brát v potaz účinnost reakce – nemusí být pro všechny stejná (2)! Detekce minimální reziudiální choroby Detekujeme přítomnost izolovaných nádorových buněk v krvi, kostní dřeni a lymfatickém systému – možné prekurzory metastáz Detekce MRD (minimal residual disease) – detekce znaků epiteliálních buněk v kompartmentech mesenchmálního původu Imunohistochemie – citlivost 1 : 10 000 Průtoková cytometrie – citlivost 1 : 100 000 PCR – citlivost 1: 1 000 000 Real- time PCR – citlivost až 1 : 10 000 000 Princip detekce mimimální reziduální choroby metodou RT-PCR – studium genové exprese TH Iveta.bmp TH Iveta2.TIF Z průběžných výsledků vyplývá detekce molekulárního relabsu onemocnění s měsíčním předstihem od klinicky diagnostikovaného relapsu datum odběru BM exprese TH genu FISH klinický stav 1. 3. 07 KD pozitivní Nmyc - KD, metastázy PK pozitivní 1p36 - v obratlech bederní páteře 1.blok CHT 30.4.07 PK KD(PS,LS, sternum) 0 před 2. Blokem CHT slabě pozitivní 26.6.07 KD (LS,PS slabě pozitivní) 0 plánovaná separace PBSC 17.10.07 PK, KD negativní lok. amp. N-myc před 2. PBSC (1-4.11.01) gain17q - VGPR 5.11.07 0 N-myc - 16.11.07 0 N-myc - 22.11.07 ABCD štěpy negativní 0 KD,PK negativní 25.1.08 PK negativní 0 před vysoce dávkovanou CHT s transplantací PBSC 27.2.08 PK negativní 0 kontrola po transplantaci 29.3.08 KD-LS negativní molekulární relabs KD-PS pozitivní 26.4.08 klinický relabs Vyšetřování onkomarkerů je obrovským pokrokem při diagnóze a sledování efektu léčby nádorových onemocnění, jejichž počet se nejen v České republice, ale i v celé Evropě každoročně výrazně zvyšuje. Vzhledem k výše uvedeným podmínkám, pravidlům použití a značné finanční nákladnosti patří jejich využití v klinické praxi spíše do ordinací odborných lékařů než do ordinací praktických lékařů. Výjimku mohou tvořit skupiny s vysokým rizikem vzniku nádorového onemocnění, obecně skupiny s profesním rizikem vzniku karcinomu, nebo případy familiárních výskytů nádorových onemocnění, tedy skupiny kontrolované praktickými lékaři. Onkomarkery Volná cirkulující DNA („cell-free DNA“,cfDNA) vje typ extracelulární DNA nachazející se v krevním oběhu vvzniká aktivním uvolňováním živými buňkami, apoptózou či nekrózou vdetekované množství cfDNA se může lišit u zdravých a nemocných jedinců a tak v závislosti na typu a případně i stádiu onemocnění. v vzvýšené hladiny se vyskytují u patologických stavů, jako je zánět, stres či autoimunitní onemocnění v CfDNA je využívána vneinvazivní metody v prenatální diagnostice k vyšetřeni fetálních aneuploidií a genotypizaci vneinvazivní metody v diagnóze a prognóze nádorových onemocnění Volná cirkulující DNA („cell-free DNA“,cfDNA) Zdroje cfDNA 1.Apoptóza je regulovaný mechanismus zajišťující eliminaci poškozených či nepotřebných buněk, kdy dochází ke smrštění buňky, fragmentaci jaderné DNA a rozpadu na apoptická tělíska, která jsou následně makrofágy fagocytózou degradována. Fragmenty DNA vznikající při apoptóze jsou přibližně 180 bp dlouhé 2.Nekróza je patologický proces vyvolaný mechanickými, chemickými či biologickými vlivy. Na rozdíl od apoptózy dochází k prasknutí cytoplazmatické membrány, narušení rovnováhy vnitřního prostředí buňky a následného vylití buněčného obsahu 3.Aktivní uvolňování živými buňkami, které přednostně uvolňují nově nasyntetizovanou DNA v nukleoproteinovém komplexu. Tento způsob uvolňování cfDNA není limitován pouze na rakovinné buňky, jelikož nebyl pozorován významnější rozdíl mezi onkologickými pacienty a zdravými jedinci (Stroun et al., 2001b). Volná cirkulující DNA („cell-free DNA“,cfDNA) Rozdíl mezi apoptózou a nekrózou. Ačkoliv oba mechanismy konči smrti buňky, apoptóza je regulovaný proces zajišťující eliminaci poškozených či nepotřebných buněk, kdy dochazií k rozpadu buňky na apoptická tělíska, zatímco u nekrózy se jedná o patologický proces vyvolaný různými vlivy končící prasknutím buňky a vylitím buněčného obsahu (upraveno dle Meer et al., 2010). Volná cirkulující DNA („cell-free DNA“,cfDNA) vje typ bezbuněčné DNA, která se nalézá v krevním oběhu ve formě fragmentů vu zdravých jedinců ji můžeme nalézt především na povrchu krevních buněk vsekvenační analýzou plazmové cfDNA zdravých jedinců bylo zjištěno, že se jedná o dvouřetězcovou molekulu s výrazným zastoupením CG párů. 5′ konec molekuly byl bohatý na cytosin, zatímco 3′ na guanin Toto zastoupení může být důležité pro stabilitu cfDNA v plazmě. vPři srovnáni koncentrace cfDNA v plazmě a séru bylo zjištěno, že nejsou shodné Ačkoli byla v plazmě cfDNA v nižší koncentraci, je stabilnější, a proto je i lepším zdrojem pro analýzy . V séru je koncentrace cfDNA vyrazně vyšší, ale její stabilita v různých časových intervalech velice kolísá. Volná cirkulující DNA a její potenciál v onkologii vvýrazné zvýšené hodnoty cf-DNA jsou patrné u pacientů s malignitami a to především v pokročilých stádiích nemoci. vV takovém to případě je nádorově specifická cf-DNA uvolňována nekrózou z buněk primárního nádoru a metastáz vcf-DNA hodnocena jako vhodný neinvazivní molekulární marker nádorových onemocnění. vkvantitativní stanovení a detekce genetických a epigenetických změn v cf-DNA u pacientů vu různých malignit má potenciální využití v molekulární diagnostice, prognóze, monitorování průběhu nemoci a odpovědi na léčbu vvyužití cf-DNA jako krevního biomarkeru u vybraných solidních nádorů a hematologických malignit Volná cirkulující DNA a její potenciál v onkologii Biopsie vodběr tkáně z živého organizmu, která se dále zkoumá histologickym vyšetřenÍm pod mikroskopem, aby mohlo byt stanoveno, zda se jedna o maligní či benigní tkáň a případně typ a stadium nádoru. vmůže byt provedena různými způsoby v závislosti na odebírané tkáni -odběr vzorků může byt proveden stěrem pomoci kartáčku, klíšťkami, dutou jehlou nebo při chirurgickém zákroku. vdélka samotného odběru a případná hospitalizace je individuální v závislosti na uložení ložiska v vúskalím klasické biopsie je, že nemusí zachytit heterogenitu nádoru Každý nádor se může skládat z více buněčných subpopulací, které se mohou v genetických změnách lišit. Volná cirkulující DNA a její potenciál v onkologii Tekutá biopsie U pacientů s karcinomy můžeme v krevním oběhu nalézt dva různé zdroje nadorově specifické DNA, které mohou byt neinvazivně hodnoceny. 1.nádorová cirkulujicí volná DNA („tumor circulating free DNA“, tcfDNA) 2.nádorové cirkulujicí buňky („tumor circulating cells“,TCCs) Tekutá biopsie Představuje neinvazivní vyšetření nádorových složek vyskytujících se v krevním oběhu Oproti biopsii klasické má tekutá biopsie určité výhody vje méně bolestivá vpředstavuje pro pacienta menší riziko vje rychlá vdíky své citlivosti a specifitě může být použita pro identifikaci molekulárních změn, které jsou zodpovědné za onemocnění pacientů vmohou byt zjistitelné genetické změny jak u primárního, tak u metastazujícího karcinomu. Aplikace tekuté biopsie, kdy je z periferní krve detekována ctDNA, která nese stejné změny na molekularní úrovni jako primarní i metastazující nádor, ze kterých je odvozena. Tekutá biopsie se dá aplikovat i při detekci rezistentních mutací, avšak není vhodná pro detekci ctDNA z mozkového nádoru. Důvodem je hematoencefalitická bariéra blokující průchod bezbuněčné DNA do krve Volná cirkulující DNA a její potenciál v onkologii Mutace, methylace, mikrostatelitni nestabilita, ztráta heterozygozyty („lossofheterozygozity“, LOH), chromosomální abnormality Volná cirkulující DNA a její potenciál v onkologii http://www.cancerworld.org/cancerworld/images/image/CW68/Liquid%20assets.jpg Volná cirkulující DNA a její potenciál v onkologii Komplexní workflow tekuté biopsie od vzorku krve po variantní data PROMISKUITNÍ DNA “Promiscuous DNA” (Ellis, 1982) “Endosymbiotic gene transfer is ubiquitous… … at frequencies that were previously unimaginable”. Nature Reviews Genetics, 2004 (a) chloroplast 20-200 kb 20-200 proteinů progenitor - cyanobacteria (Synechocystis) 3.6 Mb 3000 proteinů (b) mitochondrie 6-400 kb 3-67 proteinů progenitor - alpha-proteobacteria (Mesorhizobium loti) 7 Mb 6 700 proteinů Organelové genomy – pozůstatky prokaryot ~ 150 kb ~ 100 genů chloroplast jádro mitochondrie ? ? ~ 3000 kb ~ 3000 genů ~ 4000 kb ~ 4000 genů 10-2000 kb* ~ 60 genů sinice proteobakterie rostlinná buňka Hromadění cpDNA na chromosomu Y u Silene latifolia Endosymbiotická evoluce a strom života Lidský genom Jaderný genom 3 000 Mb cca 22 000 genů Mitochondriální genom 16,6 kb 37 genů Kódující DNA Intragenová DNA 22 tRNA genů 13 strukturárních genů 2 rRNA geny Nekódující DNA Pseudogeny Genové fragmenty Introny Nepřekládané oblasti Unikátní sekvence Repetitivní sekvence Tandemové sekvence Roztroušené sekvence 1% DNA kóduje nějaké znaky Extragenová DNA Lidský genom •jaderný •mitochondrialní nucleus+mitochondria Buněčné jádro obklopené mitichondriemi Mitochondriální genom • mitochondria Mitochondriální genom mito_enz mit DNA.jpg Mitochonriální dvoušroubovicová DNA tvoří jednu kruhovou molekulu Mitochondriální genom •Mitochodrie mají svoji vlastní DNA, relikt z dávné minulosti, kdy oni byli volně žijící organismy. •Dokladem toho jsou mírně odlišné genetické kódy nalezené v nonplant mitochondriích. Například: • • Organism Code Amino Acid (standard) All nonplant species UGA Tryptophan (stop) Mollusks AGA Serine (Arginine) Yeast CUU Threonine (Leucine) Mitochondrial genome •Exclusively maternal inheritance sperm_entering_egg Soubor:Mitochondrial DNA cs.svg mtDNA vs. choroby •cyclic vomiting syndrome –přestavby rozáhlých segmentů mtDNA •Leber hereditary optic neuropathy - mutace v genech MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, and MT-ND6 •mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes- mutace v genech MT-ND1, MT-ND5, MT-TH, MT-TL1, and MT-TV •myoclonic epilepsy with ragged-red fibers - mutace v genech MT-TK, MT-TL1, MT-TH, and MT-TS1 •neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa - mutace v genu MT-ATP6 •nonsyndromic deafness- mutace v genech MT-RNR1 a • MT-TS1 •cancer, including breast, colon, stomach, liver, and kidney tumors, cancer of blood-forming tissue (leukemia) and cancer of immune system cells (lymphoma) – somatické mutace •age-related disorders: heart disease, Alzheimer disease, and Parkinson disease - somatické mutace •Heteroplasmie, • daná buňka obsahuje určité procento mutovaných a normálních mitochondrií •od množství mutovaných mitochondrií a také od postiženého orgánu se odvíjí tzv. prahový efekt. To je právě určité množství mutovaných mitochondrií, které právě způsobí daný defekt. Právě z těchto důvodů se mitochondriální nemoci projevují ve kterémkoli věku a klinicky se projevují onemocněním zdánlivě nesouvisejících orgánů. mtDNA vs. choroby •Důvody, proč jsou mitochondrie asi 10 krát náchylnější na poškození DNA více než DNA jaderná, jsou tyto: •mitochondriální DNA nemá takové množství opravných systémů jako jaderná DNA, •mitochondrií je v buňce mnoho, tudíž jejích DNA se musí dělit stejně často, ale ne jen jedné mitochondrie ale všech mitochondrií v buňce, tudíž je větší pravděpodobnost chyby, než u jednoho jádra •mitochondriální DNA nemá histony, •mitochondriální DNA je velice blízko dýchacímu řetězci a tudíž i radikálům, které se při reakcích v dýchacím řetězci tvoří, tudíž je mnohem častější poškození její DNA těmito radikály • • C:\Dokumenty\anglpřednáška-Řeci2003\mitoch-jaderny genom.jpg The human nuclear and mitochondrial genomes • differ in many aspects of their organisation and expression 22 000 1 – 2 % Makak dvou matek. Jaderný genom (chromozómy) pochází od jedné matky, mitochondriální (cytoplazma vajíčka) od druhé. Opička má dvě biologické matky a jednoho otce. (Oregon National Primate Research) http://www.osel.cz/_popisky/125_/s_1251692574.jpg