Analyzátory ABR a krevních plynů 2022/2023 Ing. Martina Podborská, Ph.D. 1 Počátky ABR analyzátorů • původní přístroje ABR analyzátorů využívaly Astrupovu ekvilibrační metodu, kdy se stanovovalo pouze pH a aktuální hodnota pCO2 • vývojem selektivních elektrod k měření pCO2 a pO2 začala éra analyzátorů k přímému měření acidobazických parametrů a krevních plynů • tři zmíněné elektrody pH, pCO2 a pO2 umístěné v termostatovém prostoru (37oC) zasahují svými měrnými konci do skleněné kapiláry, do které se nasává měřený vzorek nesrážlivé krve • po ustálení měřících procesů na elektrodách se naměřené veličiny zaznamenají a kapilára se odsátím vyprázdní, opakovaně se promyje promývacím roztokem a připraví se k nasátí a měření dalšího vzorku krve • vedle přímoměřených parametrů (pH, pCO2, pO2) analyzátory dopočítávají další hodnoty: bikarbonáty (NaHCO3), deficit bazí („base deficit“, BD), nadbytek bazí („base exces“, BE) a saturaci hemoglobinu kyslíkem • novější analyzátory umožňují za použití ionotově-selektivních elod stanovit Na, K, Cl, Ca, Mg, v případě enzymových elod laktát a glukózu a spetrofotometricky frakce hemoglobinu (oxyhemoglobin, karbonylhemoglobin, methemoglobin) 2 Potenciometrie • měření rozdílu potenciálu (napětí) mezi dvěma elektrodami, ponořenými do analyzovaného roztoku • jedna z elektrod je referenční (srovnávací) a má konstantní potenciál, nezávislý na složení vzorku • potenciál druhé, indikační (měrné) elektrody závisí na aktivitě či koncentraci měřené látky v roztoku • rozdíl potenciálu mezi oběma elektrodami se měří milivoltmetrem s vysokým vstupním odporem 3 Ampérometrie • polarografie prováděná na tuhých elektrodách • při měření O2 se používá pO2 Clarckova kyslíková elektroda – skládá se z polarizovatelné platinové katody a stříbrné anody – na elektrody je vloženo konstantní stejnosměrné napětí > kyslík se redukuje na katodě – protékající proud se měří galvanometrem 4 Referenční elektrody • Vodíková – referenční – Pt potažená platinovou černí nasycenou vodíkem – nulový potenciál – nepraktická • Kalomelová – Hg potažená Hg2Cl2 v nasyceném roztoku KCl – stálý potenciál • Argentchloridová – Ag drátek potažený AgCl v HCl nebo alk. chloridu – stálý potenciál 5 Referenční elektroda ABL800 Flex • Argentochloridová • tvořena skleněnou trubičkou, ve které je umístěn stříbrný drátek potažený AgCl • drátek ponořen do roztoku 4M formiátu sodného (HCOONa) s pH regulovaným na 5,5 pomocí HCl -> roztok udržuje kontakt mezi potaženým drátkem a vzorkem • dolní část elektrody tvoří třívrstvá membrána • regulace koncentrace chloridů v roztoku pomocí chloridů v promývacím roztoku obtékajícím vnějšek membrány ->zabránění přechodu Cl přes membránu = stabilnější potenciál • elektroda uzavřena v elektrodovém obalu (gumový prstenec mezi nimi slouží jako prevence odpařování či unikání elektrolytu) 6 Typ elektrody Měřený iont Skleněná elektroda H+ , Na+ PVC membránová elektroda K+ , Na+ , Cl- , Li+ , Ca2+ , Mg2+ pCO2 H+ (změna pH vlivem CO2) 7 Skleněná elektroda • Reakce skleněné membrány na pH poprvé demonstrována 1906 • Praktická aplikace 1930 • Nejčastěji používaná potenciometrická elektroda • Pro měření pH v nejrůznějších matricích, vznik potenciálu na základě výměnných dějů • Souvislost s konstrukcí elektrody na stanovení parciálního tlaku CO2 (pCO2;Severinghaus 1950) - umožněna výroba analyzátorů ABR • Membrána skleněné elektrody složena ze směsi SiO2 (Al2O3) s přídavkem oxidů alkalických zemin nebo alkalických kovů • Různým složením použitého skla je možné dosáhnout různé selektivity pro měřené ionty (K+, Na+ , Cl- , Li+ , Ca2+ , Mg2+) • Vnitřní náplň 0,1 M HCl nebo pufr o pH 4-8 • Svod tvoří argentchloridová nebo kalomelová elektroda 8 Typické složení selektivní skleněné hmoty pro H+ : 22% Na2O, 6% CaO, 72% SiO2 (selektivita: H+ >>> Na+ > K+ ) Mírnou změnou složení skleněné hmoty se změní selektivita ve prospěch Na+ : 11% Na2O, 18% Al2 O3 , 71% SiO2 (selektivita: H+ > Na+ > K+ ) Tím je umožněno použití skleněné elektrody k měření Na+ při pH běžném v krevních vzorcích. 9 Měření pH • Po ponoření do roztoku s obsahem vodíkových kationtů -> difuze • H+ ionty difundují přes skleněnou stěnu elektrody do vnitřního roztoku až se vnitřní roztok nabije na takový potenciál, který začíná již odpuzovat další protony • Dynamická rovnováha - potenciál skleněné elektrody dosáhne rovnovážné hodnoty - úměrná koncentraci vodíkových iontů v roztoku • Závislost potenciálu skleněné elektrody na pH má přímkový charakter téměř v celém rozsahu hodnot pH. • pH-metry – kalibrace sadou tlumivých roztoků o známé hodnotě pH 10 11 těsnící kroužek pufr obsahující chloridový ion vzduchová bublina stříbrný drátek potažený AgCl plastikový obal pH senzitivní skleněná membrána převlečná upevňující matice pH ELEKTRODA (skleněná elektroda) 12 pH elektroda - ABL800 Flex • skleněná elektroda • náplň tvořena pufrem do kterého zasahuje Ag/AgCl drátek • Ve špičce elektrody je vzduchová bublina -> kompenzace teplotních změn objemu vnitřního pufru • Na obou stranách membrány dochází k výměně vodíkových iontů z roztoku za ionty kovu z povrchu skla • Ustanovuje se potenciál. Velikost potenciálu je úměrná rozdílu pH vnitřního pufru a měřeného roztoku = závisí na aktivitě vodíkových iontů ve vzorku • Nová elektroda musí být před instalací hydratována ponořením do destilované vody na 24 hod. (Na povrchu skleněné elektrody se musí vytvořit hydratovaná vrstva) 13 Elektroda pro měření pCO2 (Severinghaus) • Příklad aplikace použití skleněné elektrody • Tenká membrána (20 µm) propustná pouze pro molekuly plynů a vodní páry (silikon, teflon), ionty neprochází • Vrstva elektrolytu - slabý roztok bikarbonátu a chloridů ( kolem 5 mmol/l) • S elektrolytem je v kontaktu skleněná pH elektroda a referenční argentochloridová (Ag/AgCl) elektroda • Oxid uhličitý obsažený v měřeném krevním vzorku difunduje přes teflonovou membránu a rozpouští se ve vnitřním elektrolytu elektrody • Vznikající kyselina uhličitá disociuje a posunuje tak pH vnitřního elektrolytu elektrody na kyselou stranu CO2 + H2 O  H+ + HCO3 • Δlog pCO2 (vzorek) ~ ΔpH (vnitřní elektrolyt elektrody) • Vztah mezi pCO2 vzorku a signálem generovaným elektrodou je logaritmický • Elektroda může být kalibrována buď přesnou směsí plynů nebo roztokem se stabilní hodnotou pCO2 14 nylonová síťka vzduchová bublina plastikový kryt těsnící gumový kroužek Ag/AgCl referenční elektrody přepad. otvor Ag/AgCl drát roztok vnitřního pufru pH senzitivní sklo na povrchu elektrody těsnící gumový kroužek elektrolyt- vodný roztok HCO- 3 a NaCl v glycerolu pCO2 ELEKTRODA (Severinghausova elektroda) 12 µ teflonová membrána těsnící kroužek převlečná matice konektor 15 Výměna membrány na pCO2 elektrodě – ABL800 Flex 16 pO2 ELEKTRODA (Clarckova elektroda) • pO2 definován jako parciální tlak kyslíku v plynné fázi, který je v rovnováze s krví - měřen kyslíkovou elektrodou • pO2 elektroda je amperometrická (polarografická) elektroda. • Skládá se z katody (platinový drátek zatavený ve skleněné tyčince) a anody (Ag/AgCl argentochloridová elektroda) ponořených do fosfátového pufru • Plášť elektrody překryt membránou propouštějící molekuly kyslíku (polypropylenová membrána o tloušťce 20um) • Platinová elektroda je elektrickým obvodem trvale polarizovaná konstantním napětím • Polypropylenová membrána chrání platinovou elektrodu proti kontaminaci bílkovinami obsaženými v krevním vzorku • Kyslík z krevního vzorku difunduje přes polypropylenovou membránu do elektrolytu uvnitř kyslíkové elektrody a je redukován na katodě (O2 + 4e-) • Vzniká elektrický proud mezi anodou a katodou - je proporcionální parciálnímu tlaku kyslíku v krevním vzorku 17 20 µ polypropylenová membrána těsnící kroužek plastiková matka elektrolyt (H2PO4 -- , HPO4 - - a KCl) těsnící kroužky plastikový obal 630 mV vloženo na katodu těsnící kroužek Pt katoda konektor převlečná matice Ag anoda přepad. otvor pO2 ELEKTRODA (Clarckova elektroda) 18 pO2 elektroda – ABL800 Flex • Clarkova ampérometrická elektroda • složena z platinové katody (drátek o průměru 25 µm) a stříbrné anody (potažené AgCl) • vložená do plastového obalu s fosfátovým pufrem a membránou propustnou pro kyslík • polarizace konstantním napětím 630 mV • polypropylenová membrána chrání Pt katodu před znečištěním bílkovinami ze vzorku, vnitřní strana je pokryta platinovou černí • O2 ze vzorku prochází přes membránu a je redukován na katodě -> vznik proudu mezi anodou a katodou Katoda: O2 + 4H + 4e- -> 2H2O 2O2 + 4H + 4e- -> 2H2O2 Anoda: 4Ag -> 4Ag+ + 4e- 4Ag + 4Cl -> 4AgCl Peroxid vodíku se rozkládá v přítomnosti platinové černi: 2H2O2 -> 2H2O + O2 • proud úměrný parciálnímu tlaku pO2 ve vzorku • malý průměr Pt katody omezuje spotřebu O2 a velikost proudu (pikoampéry) 19 Analyzátory ABR a krevních plynů Základní měřené parametry pH pCO2 pO2 Dopočítané parametry Bikarbonáty Exces/deficit bazí Saturace Hb kyslíkem 20 Parametry měřené na analyzátorech ABR • pH • pCO2, pO2 • sO2 • cCa2+, cK+, cNa+, cCl– • Hct • ctHb, FO2Hb, FCOHb, FMetHb, FHHb, FHbF • cGlu, cLac • ctBil, cUrea, cCrea 21 Preanalytické předpoklady • anaerobní odběr • artérie x véna x kapilára • zkumavky s Li-Hep, (balancované pro Ca2+), heparinizovaná kapilára • zamezit přítomnosti bublin ve vzorcích (odstříknout), sraženinám (kapilára) • ihned po odběru důkladně promíchat • zpracování do 15 min po odběru • před analýzou na analyzátoru krevních plynů promíchat na míchačce • kapilára má uvnitř drátek sloužící k promíchání pomocí magnetu (+ nasadit adaptér/sítko) 22 23 Preanalytické předpoklady • kapilára má uvnitř drátek sloužící k promíchání pomocí magnetu (+ nasadit adaptér/sítko) 24 Preanalytické předpoklady • zkumavky s Li-Hep, (balancované pro Ca2) Radiometer - safePICO 25 Iontově selektivní elektrody • Jednotlivé ISE elektrody / Elektrody integrované integrovaná chipová technologie Ca2+ elektroda – ABL800 Flex • Iontově selektivní elektroda, jejíž snímací součástkou je PVC membrána obsahující přenašeč neutrálních Ca iontů • Iontově-citlivá membrána je krytá celofánovou vrstvou -> zabraňuje kontaktu se vzorkem • Elektrolyt má konstantní a známou koncentraci Ca2+ iontů • Když je vzorek přiveden do kontaktu s elektrodou, vyvine se napříč PVC a celofánové membrány potenciál • Potenciál je závislý na rozdílu aktivit mezi Ca2+ v elektrolytu a ve vzorku 26 Měření derivátů Hb – ABL800 Flex • krevní vzorek je transportován do kyvety s konstantní teplotou 37 °C • 1 µl vzorku je ultrazvukově zhemolyzován v kyvetě • vznik opticky čirého roztoku • pro vyloučení vzduchových bublin ve vzorku je udržován přetlak 1 atmosféry • světlo z halogenové lampy je vedeno přes infračervený filtr, prochází přes kyvetu a je dále vedeno optickým vláknem do spektrofotometru • světlo je ve spektrofotometru rozděleno na mřížce na 128 vlnových délek • změřené spektrum je zasláno do počítače analyzátoru, kde dochází k výpočtu oxymetrických parametrů 27 Měření derivátů Hb – ABL800 Flex 28 ABL800 Flex (Radiometer) • ABL 800 Flex - měřené parametry: pH, pCO2, pO2, cCa2+, ctHb, sO2, FO2Hb, FCOHb, FMetHb, FHHb, FHbF, cK+, cNa+, cCl- cGlu, cLac • kalibrace kalibračními roztoky a pomocí směsi kalibračních plynů • lze použít klasické ABR zkumavky/kapiláry i speciální Radiometer safePICO odběrové zkumavky: – uvnitř speciální stříkačky míchací kuličky (automatické míchání analyzátorem před analýzou) + zóna s polopropustnou membránou (zabraňuje interferenci vzduchových bublin) – Přístroj vybaven podavačem safePICO zkumavek – vzorek se vloží, zadá a obsluha může odejít 29 Radiometer: 30 cca 1989 31 32 pH pCO2 pO2 33 cobas b 221, Roche Diagnostic 34 cobas b 221, Roche Diagnostic • vhodný i na jednotky intenzivní péče, na operační sály, pooperační pokoje a dialýzu • čtecka ČK • stanovení bilirubinu - novorozenecká oddělení (malý objem) • 2 nebo 3 multireagenční kontejnery • kalibrace pouze pomocí kalibračních roztoků (kal. plyny se nepoužívají) – karbonáty, bikarbonáty, elektrolyty, pH pufr • detekce hladiny reagencií a záznam výměny kontejneru • Měřené parametry: pO2, pCO2, pH Na, K, Ca, Cl Glu, Lac, Urea O2Hb, HHb, COHb, MetHb Total Hemoglobin (tHb) Saturace kyslíkem (SO2) Hematokrit Hct Bilirubin 35 cobas b 221, Roche Diagnostic další vybavení • oxymetrický modul – hemoglobin celkový a deriváty – spektrofotometricky • modul na celkový hemoglobin a měření saturace kyslíku – měření absorpce světla na základě světelného rozptylu na erytrocytech 36 Siemens Rapidlab 348 • Měřené parametry: pH, pCO2, pO2, Na+, K+, Ca2+ nebo Cl• Počítané parametry: sO2, HCO3, O2CT, ctCO2, BE/BD, Anion gap, a další... • možnost měření Na+, K+, Ca2+, pO2 a pH v dialyzátu 37 Siemens Rapidlab 1200 • Měřené parametry: pH, pCO2, pO2, Na+, K+, Ca2+ , Cl-, Glu, Lac, tHb, HHb, O2Hb, sO2, COHb, MetHb, novorozenecký tBil 38 POCT analyzátory ABR soustředěny v nemocniční síti + kontrolovány laboratoří – např. software Aqure - Radiometer • soustředěny v nemocniční síti • kontrolovány laboratoří – často SW pro dálkovou správu/náhledy • Snadné použití (obvykle kazetové systémy) • Bezúdržbové • Ideální pro point-of-care • Parametry obvykle: pH; pCO2; Na+; Cl-; Ca2+; K+ (potenciometrie), pO2; glukóza; laktát (amperometrie), Hb; O2Hb; COHb; MetHb; HHb; tBil (spektrofotometre), hematokrit, cCrea, cUrea 39 Radiometer: ABL90 Flex ABL80 Flex CO-OX• Měřené parametry: pH, pCO2, pO2, sO2, ctHb, O2Hb, COHb, MetHB, HHb, HbF, K+, Na+, Ca2+, Cl-, Glu, Lac, tBil (verze ABL90 Flex Plus navíc Urea, Crea) • ABL90 Flex má zabudovaný systém míchání safePICO zkumavek 40 Nova Biomedical Stat ProfilepHOx Ultra • Měřené parametry: pH, pCO2, pO2, Na+, K+, Ca2+ , Cl-, Mg2+, Glu, Lac, Urea/BUN, Crea, tHb, HHb, O2Hb, sO2, COHb, MetHB, tBil Stat Profile Prime • Měřené parametry: pH, pCO2, pO2, (Na+, K+, Ca2+ , Cl-, Glu, Lac – v závislosti na konfiguraci) 41 Siemens RapidPoint 500 • Měřené parametry: pH, pCO2, pO2, Na+, K+, Ca2+ , Cl-, Glu, Lac, tHb, HHb, O2Hb, sO2, COHb, MetHB, novorozenecký tBil • pH ve výpotku 42 GEM Premier 5000 - Instrumentation Laboratory (dodává Medista) • pH, pO2, pCO2, elektrolyty, metabolity a CO- Oximetr. • snadné použití • bezúdržbový • ideální pro point-of-care testování 43 Techno Medica Gastat 602i 44 Biosenzory • specifický druh chemického senzoru - z biologického indikačního prvku a chemického převaděče • biologickým prvkem je nejčastěji specifický enzym enzymové elektrochemické biosenzory • enzym katalyzuje specifickou enzymovou reakci se specifickým substrátem • výsledkem reakce je měřená tvorba produktu, nebo rozklad substrátu • biosenzory pro glukosu, laktát, kreatinin a močovinu • jsou součástí glukosových analyzátorů, ABR analyzátorů, ale také velkých automatických biochemických analyzátorů (Beckman) 45 Děkuji za pozornost. 46