Průtoková cytometrie Princip a využití ve zdravotnictví Lucie Říhová Oddělení klinické hematologie, FN Brno - NBP Efakultní nemocnice brno Průtokový cytometr poprvé použit v 60. letech k měření objemu buněk specializovanější varianta fluorescenčního mikroskopu v kombinaci s krevním analyzátorem, nyní až 30 fluorescencí analýza fyzikálních, chemických a biologických vlastností až 20x106 buněk v suspenzi možnost sortování - separace raritních populací buněk Klinické průtokové cytometry BD FACSLyric (BD Biosciences) Bricyfe (Mindray) DxFLEX (Beckman Coulter) 3 Průtoková cytometríe umožňuje simultánní analýzu mnoha tisíců buněk za sekundu buňky (částice) procházejí přes paprsek laseru ° mění jeho kvalitativní i kvantitativní vlastnosti rozptýlené či druhotně emitované světlo (fluorescence) pak dopadá na detektory, kde je konvertováno na elektronický signál zisk mnoha parametrů - velikost, granularita, fluorescence... ■ Měřitelné buněčné parametry ■ Exprese proteinů - povrch, cytoplazma, jádro (imunofenotypizace) ■ Posttranslačně modifikované proteiny - vč. fosforylovaných proteinů - RNA - IncRNA, miRNA a mRNA transkripty ■ Buněčný status - živé bb, pozdně apoptotické a neviabilní ■ Buněčný cyklus - analýza buněk v G0/G1 fázi vs. S fázi, G2, případně stanovení ploidie, včetně detekce proliferace a aktivace ■ Identifikace a charakterizace různých buněčných subsetů v rámci heterogenního vzorku pomocí imunofenotypizace https://wwwJhermofisher.com/cz/en/home/life-science/cell-analysis/cell-analysis-learning-cen f luorescence/flow-cytometry-basics/f low-cytometry-fundamentals.html Složení průtokového cytometru 1. Fluidika - směřování vzorku do laserového paprsku a usměrňování jeho toku 2. Zdroj světla - signál z rozptylu na buňkách a aktivace fluorescence navázaných barev 3. Optika - sdružení a rozdělení rozptýlených paprsků dle vln. délky pomocí filtrů a zrcadel na příslušné detektory 4. Elektronika a počítačový systém - převod optického signálu na elektronický a další zpracování Složení průtokového cytometru Fluidika - usměrňování vzorku Hydrodynamická fokusace A B Low differential High differential Data spreads https://www.thermofisher.com/cz/en/home/life-science/cell-a na lysis/cell-a na lysi^^ f luorescence/flow-cytometry-basics/flow-cytometry-f u nda menta Is/f luidics-flow-cytometer.html ■ Zdroj světla LASER = Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation ■ stálý koherentní zdroj paprsků světla o určité vlnové délce X ■ přesné zacílení co největšího počtu fotonů do co nejmenšího bodu ■ dle aktivního média (k pumpování energie) a plynové, kapalinové a pevnolátkové (polovodičové/diodové) -> malé, opt. poměr příkon/výkon, nepotřebují dlouhý zahřívací čas (s) Paprsek laseru většina laserových paprsků má profil Gaussovy křivky snížení symetrie ozáření se vzdáleností od centra paprsku vysoká rychlost průtoku vzorku = nerovnoměrné ozáření využití tzv. fiat top laserů Low Flow Rate High Flow Rate Core Stream https://wvvw.edmundoptics.de/knowledge-center/application-notes/optics/why-use-a-flat-top-laser-beam/ https://www.laserfocusworld.com/optics/article/14197298/flattop-laser-beams-their-uses-and-benefits https://expert.cheekyscientist.com/what-is-a-flow-cytometry-laser-how-flow-cytomtery-optics-function/ Gaussian Superfluous Energy Ablation Threshold ...J... Top-Hat Heating Energy Spot Diameter Spot Diameter Example of beam shaping for a TEMoa laser O.jtpjl Flat-top -6 -4-1 O í -id x (mm) -5 1 -3 -JO 2 3 4 5 10 Světlo vs. buňka ___ Forward Scatter detektor - rozptyl světla v malém úhlu - velikost buňky detektor Side Scatter - rozptyl světla pod úhlem 90° - komplexita buňky detektor Fluorescence - snímána pod úhlem 90° - přítomnost fluorochromu ■ ■■ ii Fluorescence I. excitačním ztráta ErE2 = vnitrní konverze teplo + vibrační relaxace Excitovaný stav E>0 absorbce E1 fluorochrom 1emise E2 = fluorescence J^J\J\T^emitovaná Základní stav E=0 X Fluorescence II Stokesův posun n X excitace ± X emise Fluorescein 403 im 500 nm 600 rim 700 nm 400 nm 500 nm 600nm 700nm Fluorescence Resonance Energy Transfer = FRET (\J\f\][+ A #/W\/W ° excitovaný donor A předá energii a fluoreskuje B a tandemové konjugáty - citlivé na světlo (PC5, PC7, APC-Cy7...) 13 Uspořádání laserů Flow cell = průtoková komůrka Paralelní uspořádání laserů - Interakce laserů s buňkami " časové zpoždění ° vyšší počet fluorochromů Optika I Optické filtry a dichroická zrcadla ■ propustnost pro dané X a blokace/odraz jiných ■ znalost vlastního cytometru nezbytná 575 nm Short Pass Filter Long pass 700 750 800 Shortpass 460 500 540 Bandpass 460 525 590 BP 525/50 FACSAria Detector Configuration Laser Detector Name Band Pass Filter DicľKirie Filter Fkiorn chrome Detected I I 780/60 755LP U E-Cy7 710/50 685LP i 660/20 635LP E10/20 600LP 5B5/-5 570LP 530/30 505LP 488." 0 Blank -i H Blank A 610/20 30:-LP D 590/40 570LP C Blan* Red laser (S35nm) A 730/60 755LP APC-Cy7 B 660/20 Blank Violet laser (407nm) C Blank n/í A 585-42 57: L P B 525/50 5DŠLP C 450/50 Pacific Blue Light source >540 nm light reflected 15 Optika II Detekční systém/optická lavice Odraz světla = nižší ztráty E Průchod světla = vyšší ztráty E 16 Vznik signálu I. Převod světelného (generovaného vstupem buňky do paprsku laseru) na elektrický signál prostřednictvím fotonásobiče/fotodiody —► slabý fotoproud Vznik signálu II Fotoproud - zesílení, digitalizace (analog-digital převodník - ADC) a třídění signálu (binning) Rozlišeni ADC ■ dáno počtem „tříd" ■ /18-bitový ADC = 218 tříd = 262.144 tříd Sampling rate I i I I 1 i i [ I 1 Digitization of signal invitrogen Molecular Probes School of Fluorescence 18 Fluorochromy I Organická barviva ° malé stabilní molekuly ° původní = FITC a Pacific dyes ° Alexa Fluor Dyes ° eFluor Velké proteiny ° původní = PE, APC, PerCP Polymery ° Super Brights ° Brilliant violet/ultraviolet Speciální barviva ° NovaFluor Fluorescence spectra overview Violet laser Blue laser Yellow laser Red laser (405 nm) (488 nm) (561 nm) (635 nm) 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 Wavelength (nm) https://\AAAAA/ihermofisher.c^ cytometry/f low-cytometry-panel-builder.html. html https://vvww.miltenyibiotec.com 19 Fluorochromy II. Stain index ■ svítivost jednotlivých fluorochromů ■ SI = D/W Signal width D = difference between positive and negative peak medians W = the spread of the background peak (= 2X rSDnegative) E o AAFI 71.027 o -\..... -1—i—i i i i ni-1— CD138-BV421 4) S MFI 50.790 ........i— 1E1 CD138-BV480 MFI 13.37 1E4 1EG CD138-BV510 CD138-PO MFI 5.0 1ĚJ 114 1EB CD138-FITC tli o. C 4) r I I 1111-1—I I I 1111|- 164 1EB MFI 12.35 I ii 111111 ^ 111111 ii I-1—i i i 1111J— ■1E2 0 1E2 1EJ CD13S:PE-A pMFI 18.54 1E4 1ES O i I I I I I I 1E4 1ES CD138-PerCP MFI 8.05 1E4 1EI CD13S-APC ■ 20 Kompenzace V důsledku spektrálního překryvu emisních spekter dochází k tomu, že signál jedné fluorescence je zachycen i na fotonásobiči následující fluorescence -> falešná fluorescence FITC - filtry - PE FITC FITC zasahující do PE - falešný prídavný signál! úprava - zvýšení % odstranění FITC z PE, resp. PE z FITC fotonásobiče 21 Analýza a zobrazení leukocytární gate monocytární gate lymfocytární gate debris FS lín 1023 SS lin FS - forward scatter - velikost buněk SS - side scatter - granularita/komplexita ■ ■■ 22 1-parametrová analýza Histogram ■ osa x - intenzita fluorescence, osa y - počet buněk ■ hodnocení - odečet % pozitivních buněk ° neg. peak = autofluorescence, izotypová kontrola a poz. peak - low (+/-) < dim (+) < high, bright (++) < very high (+++) ° porovnávání intenzity exprese - medián intenzity fluorescence (MFI) 23 2-parametrová analýza Dot plot ■ dva parametry proti sobě - FLx vs. FLy, FLx vs. FS či SS ■ procentuální hodnocení - nejčastěji kvadrantová analýza pe I03- I01- 10° F1 1. II. 3 III V /IV. 10° I01 I02 I0S I. kvadrant - FITCPE+ II. kvadrant - FITC+PE+ III. kvadrant - FITCPE IV. kvadrant - FITC+PE FITC Green Fluorescence 24 Multiparametrová analýza využívá Principal Component Analysis (PCA) ° transformace sloužící k dekorelaci dat ° snížení dimenze dat s co nejmenší ztrátou infomace APS - automatic population separator (Infinicyt) < u O -—I <í O „ H s Q CD19+ leuko < o 5, <í 1EÍ 1E4 1E4 1Ei CD45:Pacific Blue-A LOGICAL CD20^APCAF750:APC-eFliior78 APS 1 CD38FITC-A LOGICAL 26,83 CD10:APC-A LOGICAL 21,29 CD20-APCAF750:APC- ,n ,„ aFluor780-A LOGICAL ' CD34:PE-A LOGICAL 10,83 CD45:Pacific Blue-A LOGICAL 8,17 CD5-PeiCPCy5-5:PerCP-A LOGICAL ■ CD19:PE-Cy7-A LOGICAL 3,50 FSC-A LINEAR 1,63 CD138-BV510:Pacific Orange-A LOGICAL 1,56 FSC-H LINEAR 1,86 SSC-A Exp-SSC Low 0.11 SSC-H Exp-SSC Low 0.05 Sortování subpopulací 1 Presné časování buněk - znalost jednoznačné polohy buněk od průchodu laserem bezprostředně po analýze dochází piezoelektricky k „trhání" proudu vzorku na kapky - obsahující jednu buňku požadovaným buňkám = kapkám je udílen el. náboj vychylování nabitých kapek v el. poli a separace vhodné pro raritní populace buněk (alternativa imunomagnetické separace) časově náročné možný aseptický sort ^ ^ j 26 Kontroly kvality (QC) I Interní f IKK) - závislé na přístroji ■ Kontrola optického nastavení a fluidiky přístroje I firemní fluoreskující částice pro kalibraci prístroje tak, aby byl každodenně stejně nastaven (cílové hodnoty MFI) ■ Kontrola optického nastavení II komerční fluorescenční částice pro mezipfístrojové nastavení ■ Vnitřní kontrola správnosti (buněčná) stabilizovaná krev s presným počtem (relativním i absolutním) základních subpopulací lymfocytů -> nástroj pro verifikaci metody -> akreditace Externí f E K K) - nezávislé na přístroji a reagenciích - AALP, SEKK - buněčné 27 Kontroly kvality (QC) II Kontrola optického nastavení přístroje - CST, PTB... i mm m ■ i............'................ľ' "i FSC-A * ,M°> ~ir— ■ M f- BTltt E3P3 a« SPÍ £3p7 H" Bps 0P'O 0pn 0p12 0p13 0P1I E3pis Hus : 0pi7 Hpib #E»ents ' 10.000 2.949 5.117 2.522 2.599 2.543 2.599 3.S14 2.600 2.212 2.600 2.529 2.599 2.546 2.600 2.546 2.599 2.546 2.600 283 61 6 490 50 5 49 4 505 469 505 430 505 491 505 495 50 5 495 505 495 50 5 »Total 10O0 295 51,5 25.2 260 25 4 26 0 251 260 221 260 253 26 D 25 5 260 25 5 26 0 255 26 0 EP? Hpio 0P1I S pi 2 E pi* 0p15 0P16 0P17 0P1B FlTC-A PEA Mediae Median PerCP-A Median PE-Cv'-A Median APC-AAPC-eFI Mtďtan Median Pacific Median Pacrtlc Median 2 67 7.644 7.64* 287 7.644 2«7 7.644 265 7.844 7.644 265 7.644 355 12.287 355 12.287 353 12,287 355 12,287 355 12.287 355 12.287 355 12.287 355 12.287 14,033 440 14,033 440 14,033 440 14,033 440 14.033 440 14.033 440 14.033 440 14.033 10,469 17,367 10,469 17.367 10.469 17.368 10.469 253 10.469 253 10,469 253 10,469 253 10,469 17.368 734 1.089 33.646 1.060 33.646 1,089 33.647 1.089 33.647 1.089 17.367 33.646 734 1.089 17.368 33.647 734 1.089 17.367 33.646 734 1.089 17.368 33.647 14.596 680 14.596 680 14.597 682 14.597 680 14,596 680 14,587 680 14.596 680 14.597 4 D. 904 1.487 40.904 1.488 40,904 1,485 40,904 1.485 40.904 1,495 40,904 1.485 40.904 i 5fi CST iqi 921 si Tube t to* w' ifl* tf FľTC-A CST 10192181 Tube CST 101921 BI-Tupé •U -H^A.ill-n^J t/J 0 1(T 10 10 10 APC-eFIUOf780-A CSTIOt92181-Tube ľUJtl-J.....i CSTIqt82181-Tube CSTiQl9?i8i-TutJŕ »0" ic3 id* ia! Pactfit Orange-A " i ' I 1 1 " I i» »0 mc SC-A <* ]m> ľ x ň Ö G G Metal-labeled Ab Staining cells with _^ Nebulization of metal-labeled Abs single-cells (B)_ Time-of -flight (TOF) mass spectrometry Metal mass \ Mass profiles for every single cell in sample Single-cell data analysis 66 nevhodná pro minoritní populace existence komerčních panelů protilátek pro vyšetření zejm imunitního systému vizualizace dat ve speciálních SW SPADE V. ÍH 1.1.1 Gating by Clustering Gating by dimension reduction Raw data Identified Cellular Populations Raw data liansformalion SPADE ViSNE itc Hcoa-tc ■co*' tc Bdc Slaiisiic summary Ä data interpretation flowSOM ll'SCIHIII •••••-•••• ttoooo**** • •ÖOOOCM J Plaimacyloid DC Myelocytic » C038™ C03- plalctol CD38- CO}- ploleloť C038"" CD3™platetax ■ CM* lni ■ W«É« ■ »CT u*i flowPeaks: a fast unsupervised clustering for flow cytometry data via K-means and density peak tinding. Ge Y, Sealfon SC. Bioinformatics. (2012) Unraveling cell populations in tumors by single-cell mass cytometry. Serena Di Palma, Bernd Bodenmiller. Curr Opin Biotechnol (2015) Zobrazovací cytometrie Flow cytometr se zobrazovacími a funkčními vlastnostmi mikroskopu ■ přímé zobrazení buněk s 60 násobným rozlišením ■ simultánní fenotypové a funkční analýzy s využitím 5 laserů a 12 zobrazení na buňku ■ 37 Spektrální cytometrie I. ■ progresivní technologie pronikající do rutinní diagnostiky ■ znalost spekter negativní/nebarvené kontroly a jednotlivých pozitivních kontrol dle použitých konjugátů ■ definice spektrálního „fingerprintu" referenčních fluorescencí i auto-fluorescence ■ mnohobarevný vzorek je porovnáván s jednotlivými kontrolami -> matematické rozložení na jednotlivé spektrální komponenty -> grafické znázornění ve formě dot plotu ■ není potřeba kompenzace! ■ ■■ 38 Spekträlnf cytometrie II Flat-top beam: Ensures quantitatve data (fluorescence intensity) even if the stream line of each cell changes in the microfluidic channel V J 488 nm| UP iel I y Fluorescence (500-800nm) 1/-\ Prism array Flat top optics 638 nm Dual lasers Micro lens array 32ch PMT Spot size -100 x 6 pm Astigmatic optics & Quadrant photodif"' 9 PMT Channel 1 5 10 15 20 25 30 32 500 550 600 650 700 750 Wavelength [nm] 800 Spektralnf cytometrie II Sample Unmixing Results i F 1 Igorithm t 488nm Laser - Unstained BV421 BV510 405nm/638nm lasers Reference Spectra RTC PE BV605 PerCP-CyS.S PE-CyV AF647 A: flJO APC-Cy7 25 "^j 11 ^ "*y** iU»yj *^ 40 parametr průtoková cytometrie konvenční mikroskopie stupeň jednoduchosti vysoký střední rychlost vysoká nízká počet analyzovaných buněk vysoký nízký absolutní počet buněk presná nepřesná senzitivita vysoká střední/nízká specificita vysoká vysoká počet parametrů >10 <3 antigenní exprese kvantitativní kvalitativní antigenní lokalizace omezená detailní morfologické parametry 2 >10