Hematologické analyzátory
(Analyzátory v hematologické laboratoři)
Oddělení dětské hematologie a biochemie FN Brno
Magdaléna Jelínková
Analyzátory v hematologické laboratoři
 Hematologické analyzátory
 Digitální morfologie (DM)
 Koagulometry
 Flowcytometry (FCM)
 Agregometry
 PFA
 Trombinoskop (TGA)
 Vidas
-----------------------------------------------------------------------------------
 Trombelastograf (TEG)
 ACT
-----------------------------------------------------------------------------------
 Selfmonitoring
 poloautomaty
 automatické analyzátory
 zařazení do linky
 3populační diferenciál
 5populační diferenciál (6populační(+IG))
+ retikulocyty + normoblasty
 Až cca 80 měřených a počítaných
parametrů
 Hematologické linky:
+ nátěrový automat
+ barvící automat
+ digitální morfologie
www.sysmex.cz
Hematologické analyzátory
(analyzátory krevních elementů)
Zjišťované základní veličiny
Přímo měřené
 RBC
 WBC
 PLT
 MCV
 Hgb
 Neut
 Lym
 Eos
 Baso
 Mono
 Ret
 NRBC
Počítané
 HCT
 RDW
 MCHC
 MCH
 Parametry destiček
 Parametry retikulocytů
 …
Průtoková cela
 Hydrodynamická fokusace
 hydrodynamicky zaostřený proud (laminární proudění)
 Reagencie (izotonický roztok) obalí vzorek krve
Různé principy
 Impedance
 Optika
 fluorescenční průtoková cytometrie
 rozptyl laserového paprsku
 Vysokofrekvenční elektrické pole
 Cytochemické metody
 Imunofluorescenční metody
Příklad jednoho typu analyzátoru
Impedance
 Vně i uvnitř měřící kyvety –
polarizované stejnosměrné
elektrické pole (2 elektrody)
 Vnikne-li částice do kyvety –
změna odporu prostředí
 Každá buňka vybudí jeden
napěťový impuls, jehož velikost
je přímo úměrná objemu částice
 Stanovení počtu RBC, PLT
Impedance – histogramy I
REFERENČNÍ METODA
Kyanmethemoglobinová metoda
Fe2+ Fe3+ (methemoglobin)
Fe3+ kyanmethemoglobinový komplex
Spektrofotometrie
absorbční maximum při 540 nm (přímo úměrné konc. Hb)
Stabilní pigment, toxický, dlouhá reakční doba
Oxidace (ferrikyanid draselný -K3Fe(CN)6 )
CN- (KCN)
Fotometrie – stanovení koncentrace
hemoglobinu
Bezkyanidová metoda (SLS)
Lýza krvinky – uvolnění intracelulárního HGB
Fe2+ Fe3+ (methemoglobin)
Fe3+ SLS-hemoglobinový komplex
SLS = laurylsulfát sodný
reakce 10 s
absorbance 555 nm
Oxidace (SLS)
SLS
Fotometrie – stanovení koncentrace
hemoglobinu (současnost)
Stanovení diferenciálu leukocytů
 Optické metody
 Fluorescenční průtoková cytometrie (FCM)
 Rozptyl laserového paprsku
 Vysokofrekvenční elektrické pole (VCS)
 Cytochemické metody
 Imunofluorescenční metody
 Buňky jsou vystaveny úzkému paprsku světla
 Rozptyl světla (různé úhly, polarizace)
 Absorpce (barvení)
 Fluorescence (barvení)
• Lampy (wolframová, Hg, Xe)
• Lasery (Ar, Kr, HeNe, HeCd, semikonduktorové)
• Diodové lasery (modrý, zelený, červený, fialový)
Optické metody
a) Čelní rozptyl světla = forward scatter light (FSC)
 Malý úhel (1-6 o)
Objem buněk
Optické metody – rozptyl laserového
paprsku
b) Boční rozptyl světla = side scatter light (SSC)
• Vnitřní charakter buňky
(granulace cytoplasmy,
členitost jádra)
Optické metody – rozptyl laserového
paprsku
 barvení – cytochemické
metody
(např. myeloperoxidáza)
Optické metody – absorbce světla
 Perforace buněk
 Použití fluorochromů s různou afinitou k nukleovým
kyselinám (DNA, RNA)
 Stanovení:
 Retikulocytů
 NRBC
 IG
 IPF
Optické metody – fluorescenční detekce
 Průtoková cytometrie (Flow cytometry - FCM)
 standardní metoda analýzy částic (buněk) v suspenzi
 multiparametrická analýza
 vysoká propustnost (tisíce elementů za vteřinu)
 Hematologické analyzátory – kombinace FCM a
rozptylu laserového paprsku (Sysmex)
• Forward Scatter (velikost buňky)
• Side Scatter (hustota vnitřní struktury buňky)
• Side Fluorescence Light (aktivita buňky a stupeň vyzrálosti
buňky)
Optické metody – fluorescenční detekce
Scattergram populace leukocytů
PLT
 Impedančně (PLT-i)
 Opticky (PLT-o)
 Fluorescenčně (PLT-F)
 Imunologicky (povrchový antigen CD61)
Retikulocyty
 plná krev
 krev je smíchána s fluorescenční barvou
 obarvení RNA
- mladé erytrocyty se zbytky RNA a ribozomálních struktur v cytoplazmě
NRBC
 Jaderné erytrocyty (normoblasty)
 Jaderné RBC žijí v kostní dřeni
a za fyziologických okolností se
v periferní krvi nacházejí pouze
u novorozenců
Digitální morfologie
 Automatizace mikroskopického
hodnocení diferenciálu leukocytů
v periferní krvi
Přístroje používané
v koagulační laboratoři
 Koagulometry
 Agregometry
 PFA 100 (200)
 Vidas
 TGT
 Spektrofotometr, ELISA reader,…
 TEG
 ACT
Metody měření koagulačního času
 Manuální
 Přístrojové
Koagulační metody měří čas od přidání startovací
reagencie do vzniku fibrinového vlákna ve vzorku plazmy
 Fyzikální detekce
• Detekce fibrinového vlákna (vodivost)
• Elektromechanické vibrace a rotace (viskozita)
 Optická detekce
• Rozptyl světla - nefelometrie
• Propustnost světla – turbidimetrie
Koagulační metody
způsoby detekce
Fyzikální detekce
 kuličkový koagulometr
 malá kulička, kývavý pohyb
 elektromagnetický senzor
 měří změnu frekvence a amplitudy kuličky
Princip – koagulační (viskozita)
 Během koagulace vzrůstá viskozita plazmy
 Tento růst viskozity je měřen pohybem např. nerezové ocelové
kuličky, která se pohybuje mezi dvěmi drážkami v kyvetě s plazmou
 Pohyb kuličky je tvořen elektromagnetickým polem,
které působí na kuličku střídavě ze dvou stran
Jakmile je nastartována koagulace (přidáním startovací reagencie)
viskozita plazmy začne vzrůstat, což má vliv na pohyb kuličky
 Oscilační amplituda kuličky se zmenší
 Měří se změna frekvence a amplitudy kuličky
 Této změny se využívá k určení koagulačního času
Optické koagulometry
 Vzorek plazmy je po přidání startovací reagencie vystaven
světelnému záření (viditelná oblast)
 Změny v optické hustotě plazmy při vzniku koagula jsou ve velmi
malých časových intervalech monitorovány jako změny v intenzitě
světla rozptýleného při průchodu vzorkem
 Rozptýlené světlo dopadá na fotodiodu a indukuje vznik elektrického
impulzu, jehož amplituda roste úměrně s intenzitou dopadajícího
světla
 Koagulaci přístroj hodnotí jako ukončenou tehdy, když se zastaví
nárůst amplitudy impulzů
 Na základě amplitudy elektrických impulzů je vytvořena koagulační
křivka
Optické koagulometry
 Koagulační čas je stanoven nejčastěji metodou procentuální
detekce
 Intenzita rozptýleného světla je stanovena ihned po přidání
startovací reagencie a je definována jako 0 %
intenzita světla po ukončení koagulace jako 100 %
 Bod detekce koagulace je stanoven na koagulační křivce
mezi 0 % a 100 %,
nejčastěji je užíváno 50 %
Koagulační čas je potom časem, ve kterém bylo dosaženo
nastavené intenzity rozptýleného světla
Další principy měření na
koagulačních analyzátorech
(kromě koagulačních metod)
• chromogenní metody
• imunoturbidimetrické metody
Principy měření - příklady
Chromogenní
 Antitrombin
 Protein C
 Faktor VIII, IX…
 Alfa2 – antiplazmin
 Plazminogen
 …
Koagulační
 PT
 APTT
 TT
 Fibrinogen
 F II, V, VII, X
 VIII, IX, XI, XII
 …
Imunoturbidimetrie
 D-Dimery, vWF:Ag
 …
 optický
 impedanční
Agregometr
Agregometr - optický
 Sleduje se změna optické hustoty
během agregace ve speciálně upraveném nefelometru
– agregometru
Agregometr optický - princip
 kvantitativní měření agregace je založeno
na Bornově turbidimetrické metodě
 PPP plazma (100% transmise)
 PRP plazma (0% transmise)
 LED, 650 nm
 míchání v kyvetě
 37 0C
 Účinkem některých látek (stimulátorů
agregace) dochází v plazmě bohaté
na destičky (PRP) ke vzájemnému
shlukování (agregaci) krevních destiček
Agregace
• samovolná
• indukovaná
• ADP
• kolagen
• ristocetin
• adrenalin
• kyselina arachidonová
• trombin
• kationický propylgalát sodný
Agregace indukovaná
Monitorování primární hemostázy
PFA 100
PFA 200
PFA 100 (200)
- rychlé získání informací ke stavu
primární hemostázy
- 2 typy měřících cel – membrána
pokryta col/epi nebo col/ADP
- 800ml plné citrátové krve
- sledování tvorby destičkového
trombu, který postupně vyplňuje
otvor v membráně potažené buď
col/epi nebo col/ADP
Výsledkem testu je čas potřebný
k dosažení kompletního uzávěru
otvoru membrány – closure time
(CT)
PFA 100
PFA 100 (200)
NH:
 kolagen / epinefrin (85 – 165 s)
 kolagen / ADP (71 - 118 s)
Závisí na:
 počtu trombocytů
 funkci trombocytů
 vWF
 Htc
 Afibrinogenémii
Nezávisí na:
 koagulačních faktorech (VIII, IX, XI)
 kumarinech
 heparinu
Přístroje používané i mimo
koag. laboratoř
JIP, ARO:
 TEG
 ACT
Trombelastograf (TEG)
 již od roku 1948
 inovace - ROTEG
 rychle dostupný komplexní přehled hemostatické situace
u pacienta
 dochází ke změně
elasticity během tvorby
trombu mezi stěnou
kyvety a pístem
Trombelastogram
 r-time (čas od přidání Ca2+ do první známky formace fibrinu)
 k-time (kinetika tvorby trombu)
 maximální amplituda (zjišťuje pevnost a stabilitu sraženiny, fce koncentrace
Fbg, počtu Plt a jejich kvality, interakce mezi fibrinem a destičkovou zátkou)
ACT
 Aktivovaný koagulační čas
 Z plné krve
 Monitorování vysoce dávkované léčby heparinem
 Použití u extrakorporálních oběhů,
ECMO
 ARO, JIP, kardiologie, dialýza