https://euc-powerpoint.officeapps.live.com/pods/GetClipboardImage.ashx?Id=87fc2def-abce-438e-a555-6 96643a18fee&DC=GEU5&wdoverrides=GetClipboardImageEnabled:true n https://euc-powerpoint.officeapps.live.com/pods/GetClipboardImage.ashx?Id=a6013fc3-dcbb-4a1a-b9af-b 7a0f37ed0da&DC=GEU4&wdoverrides=GetClipboardImageEnabled:true Materiál pro cytogenetické vyšetření n nperiferní krev nvzorky různých tkání (biopsie kožní) nbuňky plodové vody, choriových klků, placenty npupečníková krev nbuňky kostní dřeně nvzorky solidních nádorů n I. Metody molekulární cytogenetiky FISH (fluorescenční in situ hybridizace) detekce balancovaných i nebalancovaných změn 493-04 t(11-14)fotka1 2Lfe-screen-agilent Mnohobarevná FISH – M FISH; Spektrální karyotypování (SKY) detekce balancovaných i nebalancovaných změn v genomu Array-CGH Agilent´s Human CGH Microarray Kit detekce nebalancovaných změn v celém genomu MLPA (Multiple Ligation-dependend Probe Amplification) detekce nebalancovaných změn FISH = fluorescenční in situ hybridizace n1969 Parduová a Gall – radioaktivní značení n1986 Pinkel a spol. - fluorescenční značení (FISH) n nHybridizace sondy (značené fluorescenčním barvivem) s chromozómy na cytogenetickém preparátu n Postup FISH Zhotovení kvalitních preparátů 1.Denaturace sondy i cílového místa 2.Hybridizace 3.Odmytí 4.Barvení pozadí 5.Hodnocení pomocí fluorescenčního mikroskopu dapi Umožňuje detekci balancovaných i nebalancovaných změn v interfázních buňkách i v mitózách • fluorescenční mikroskop vybavený sadou fluorescenčních filtrů • citlivá ČB kamera • počítač a specifické programové moduly pro aplikace FISH, M-FISH FISH Vybavení lucia obr1 FISH FISH : Typy sond nCelochromozomové nCentromerické nSondy subtelomerické nSondy lokus specifické n n Sondy pro jedinečné sekvence: na) plazmidové (500pb-5 kb) nb) kosmidové (20-50 kb) nc) bakteriofág lambda (8-15 kb) nd) YAC klony (50-1000 kb) n typy sond Značení DNA sond nfluorochromy, Texas Red, Spectrum Green, Spectrum Orange, FITC, TRITC SpectrumAqua, SpectrumGold, aj n ( celo15h jedinh FISH : Přítomnost, počet a poloha signálů delece exonu počet signálů translokace Identifikace každého chromozómu pomocí jedinečné kombinace 5 fluorochromů FITC, Rhodamin, TexasRed, Cy5, Cy5.5 •referenční spektra - pseudobarvy, přiřazeny každému chromozómovému páru na základě měření vlnových délek Nevýhody - potřeba kvalitních mitóz - úspěšná hybridizace - finančně nákladné Umožňuje odhalení balancovaných a nebalancovaných ( i kryptických ) přestaveb celého genomu v jednom kroku Mnohobarevná FISH (M FISH) Spektrální karyotypování (SKY) vícebarevné FISH techniky – detekce více značených sond na jednom preparátu Speicher a kol., 1996 (M-FISH), Schröck a kol., 1996 (SKY) nmikroskop vybavený 6 fluorescenčními úzkopásmovými filtry (pro 5 fluorochrómů + DAPI) nSp. Aqua nSp. Green nSp. Gold nSp. Red nF. Red nDAPI n nsnímání jednotlivých fluorochromů, složení obrázku, počítačová analýza - dle kombinace fluorochromů přiřazení pseudobarev Polychroic mirror CCD array placed at primary focus of microscope objective emission or barrier filter fluorescent specimen on slide Mnohobarevná FISH (M FISH) nmikroskop vybavený 2 fluorescenčními filtry (SKY, DAPI) nfluorochromy (FITC, Rhodamin, TexasRed, Cy5, Cy5.5))snímány jedním filtrem, speciální počítačový program přiřadí na základě měření vlnových délek každému páru chromozomů barvu, ty se označují jako pseudobarvy n Image Acquisition with SkyVision™ Spektrální karyotypování (SKY) specdapi2 kalab-SKY Obr. 10 (Dokumentace OLG FN Brno) SKY - komplexní karyotyp m banding3 m banding5 Mnohobarevné pruhování (M-banding) § parciální malovací sondy ze specifických oblastí chromozomů § fluorescenční signály jednotlivých sond se podél sledovaného chromozomu částečně překrývají a dochází k jejich kombinaci § umožňuje rozlišení intrachromozomových přestaveb (inverzí) Komparativní genomová hybridizace na čipech (array-CGH) • Efektivní metoda celogenomového screeningu nebalancovaných přestaveb chromosomů během 1 hybridizační reakce • Založena na společné hybridizaci různě značených vzorků DNA (testované DNA a referenční DNA) na DNA mikročip pokrytý fragmenty oligonukleotidů • Ztráta či zisk genetického materiálu v testované DNA je odečten ze spotů vykazující abnormální poměry intenzit signálů Kdo je vhodným pacientem? • Pacienti s intelektuálním postižením, poruchami autistického spektra, vrozenými vývojovými vadami, stigmatizací... • Prenatální indikace z důvodu abnormálního průběhu gravidity (abnormální prenatální screening) • Tkáň potracených plodů • Vzorky nádorové tkáně Array CGH Materiál: • DNA izolovaná z biologického materiálu vyšetřovaného jedince • Prenatální – amniocyty, buňky choriových klků, lymfocyty fetální krve, buňky z tkání potracených plodů (kůže) • Postnatální – lymfocyty periferní krve • Onkologický materiál – nádorové buňky (solidní nádory, hematologické malignity) • DNA referenční (nejčastěji komerční příprava) • do reakce 500-1500 ng DNA dle typu platformy mikročipu • nutná přesná kvantifikace – do reakce shodná množství DNA reference a testované DNA • Kontrola kvality DNA (A260/280, A260/230, integrita DNA) • Solinas-Toldo a kol., 1997 • vyhází z principu klasické (chromosomální) CGH • nahrazení chromozomů separovanými klony (BAC, c-DNA klony, oligonukleotidy) n Array-CGH CGH Původ metody array-CGH Array CGH: proces Krok 1-3: DNA pacienta a DNA reference jsou fluorescenčně značeny a aplikovány na mikročip Krok 4: Kompetitivní hybridizace DNA na mikročip Krok 5-6: Intenzita signálů je měřena pomocí skeneru mikročipů Krok 7: Počítačový software analyzuje data a generuje profily lsca_104b_aCGH Princip array-CGH Agilent Human CGH Microarray Oligo arrays • 8x15K custom chip • 4x44K 43 kb rozlišení • 2x105K 21 kb rozlišení • 1x244K 9 Kb rozlišení Nové typy – Sure Print G3 Human • 8x60K 41 Kb rozlišení • 4x180K 13 Kb rozlišení • 2x400K 5 Kb rozlišení • 1x1M 2 Kb rozlišení geFeatured6_fig1 rna_microarray_13 HRCGH negativní 8x15K negativní 4x44K del(1)(p36) 2x105K del(1)(p36) del(1)(p36), cca 3 Mb aCGH Analytics Software, Agilent Technologies Array CGH : vyhodnocení Výhody a nevýhody metody array-CGH + Celogenomový screening nebalancovaných submikroskopických chromosomových aberací + Rozlišení dáno parametry použitého mikročipu + Nevyžaduje přítomnost mitóz + Možnost detekce mozaiek (< 30 % dle kvality vyšetření) - Genomová DNA o dostatečné koncentraci a integritě -Není možné detekovat balancované přestavby chromosomů, ani změny ploidie -Vyšší cenové náklady -Zkušenosti s interpretací vzácných nálezů - práce s databázemi, literaturou - Interpretace nálezů CNVs musí probíhat vždy v kontextu s: 1.Fenotyp jedince 2.Vyšetření rodičů -> stanovení původu CNVs (de novo/zděděná CNV od rodiče s normálním/patologickým fenotypem) 3.Informace v databázích genetických variant (UCSC, DECIPHER, DGV...) a o genech v oblasti CNVs (databáze OMIM) 4. Informace v relevantní vědecké literatuře (Pubmed...) •jedná se o speciální formu multiplex PCR, při které se amplifikují MLPA sondy a ne zkoumaná DNA •detekuje změny počtu kopií ( především rozsáhlejších delecí/duplikací ) až 50 specifických sekvencí v jedné PCR reakci •dokáže odlišit sekvence lišící se v jediném nukleotidu; •další aplikace – stanovení SNP, metylace v promotorové oblasti • Citlivá: jen 20 ng DNA Specifická: MLPA je schopná odlišit sekvence lišící se v jediném nukleotidu Jednoduchá: MLPA reakci je možné uskutečnit v jedné zkumavce Relativně levná metoda: Kit obsahuje všechny potřebné reagencie, potřebné vybavení je bežnou součástí všech molekulárně-biologických laboratoří MLPA princip PCR primer Y Hybridizačná sekvencia PCR primer X vložená sekvencia (odlišná pre každú sondu) Hybridizačná sekvencia Syntetický oligonukleotid 50-60 bp M13-derivovaný oligonukleotid 60-450 bp MLPA princip MRC Holland, www.mlpa.com Pacient Kontrola MLPA princip II. Využití metod molekulární cytogenetiky v klinické genetice dle typu aberací Detekce numerických změn: aneuploidie (monozomie, trizomie,…) Detekce strukturních změn: -balancované: inverze, reciproké translokace, robertson. translokace,… - nebalancované: -Mikrodelece (mikrodeleční/mikroduplikační syndromy, CNV,..) -Subtelomerické přestavby -Nebalancované translokace -Marker chromozomy -Izochromozom; ring chromozomy,… Detekce LOH, UPD Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady) numerické změny: Downův syndrom 47,XX/XY,+21 +21 fish +21karyo FISH Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady) numerické změny: Klinefelterův syndrom n47,XXY nvysoká postava, porucha růstu vousů, ženská distribuce podkožního tuku, PMR 3 klein Klinefelter FISH Využití metod molekulární cytogenetiky (příklady) numerické změny: Turnerův syndrom n45,X nchybí jeden chromozom X n1/2500 dívek n95 % SA nmalá postava, chybí vaječníky až sterilita Turner turner FISH nvýskyt v populaci s četností asi 1 : 500 nneovlivňují jednoznačně fenotyp nositele (5 x vyšší výskyt v populaci mentálně retardovaných pacientů) nvýznamná příčina sterilit u přenašečů nv důsledku aberantní meiotické segregace vznik gamet s nebalancovanými přestavbami (duplikace, delece) nMetoda FISH, karyotyp recip_gametes Využití metod molekulární cytogenetiky strukturní změny: balancované translokace sejmout0002 1. Karyotyp 46,XX,add(1) Využití metod molekulární cytogenetiky strukturní změny: nebalancované translokace 2. CGH: rev ish enh (11p15-pter) ZemanovaWCP 3. FISH: der(1)t(1;11) nskupina geneticky podmíněných chorob, jejichž příčinou jsou drobné mikrodelece DNA segmentů (2-4 Mb), které nejsou detekovatelné klasickými cytogenetickými metodami npacienti mají specifické klinické příznaky…dříve popis dle fenotypu („phenotype first“…) nnyní přístup „genotype first“ …nejprve nález, srovnání velikosti, genů – vliv na fenotyp n nrekurentní - vznikají opakovaně ve stejném místě na chromozomu …např. del 22q11 nnerekurentní - mohou vzniknout kdekoliv v genomu … n Využití metod molekulární cytogenetiky strukturní změny: Mikrodeleční syndromy Mikrodeleční syndromy: Nejčastější mechanismy vzniku rekurentních a non-rekurentních mikrodelečních/duplikačních syndromů n n Rekurentní mikrodelece n n n n Non-rekurentní mikrodelece n D:\Dita\Desktop\NAHR_1.png Nerovnoměrná homologní rekombinace Zastavení replikační vidlice a přeskok na odlišný templát D:\Dita\Desktop\FOSTES.png Spojení nehomologních konců Mikrodeleční syndromy •růstová retardace •dysmorfismus •stigmata •mentální retardace •malformace •vrozené vady Obecné příznaky: Jsou způsobeny mikrodelecí úseku chromozomu – většinou 2 – 4 Mb Nejčastější rekurentní mikrodeleční syndromy: DiGeorgeův/Velokardiofaciální syndrom Prader-Williho a Angelmanův syndrom Williamsův-Beurenův syndrom Využití metod molekulární cytogenetiky FISH: detekce mikrodelečních syndromů – např. del 22q11 DiGeorge syndrom n nSRDEČNÍ VADY nANOMÁLIE TVÁŘE nPORUCHY IMUNITY n Využití metod molekulární cytogenetiky FISH: DiGeorge syndrom del 22q11 D:\Dita\Documents\Skripta\PřF - 11\Bi9015 Diplomová práce MBG IV\DP\Obrázky\TBX1_22q13 sonda.png Dvoubarevná FISH D:\Dita\Desktop\FISH22q11.png Obrázek: Ukázka normální mitózy a mitózy s mikrodelecí 22q11 vyšetřená pomocí techniky FISH (de Ravel et al., 2007; upraveno) Obrázek: Příklad komerčně dostupných sond pro detekci mikrodelece 22q11 (www.cytocell.co.uk) Využití metod molekulární cytogenetiky MLPA: DiGeorge syndrom del 22q11.2 SALSA MLPA probemix P250-B2 DiGeorge contains 48 MLPA probes with amplification products between 129 and 487 nt: 29 probes are located in the 22q11.2 region and can be used to distinguish the most common types of deletion. Nineteen probes are present for relevant regions of DiGeorge syndrome (DGS), DGS type II or disorders with phenotypic features of DGS on 22q13 and on chromosomes 4q, 8p, 9q, 10p and 17p. Array-CGH profil DNA pacienta s mikrodeleci 22q11 o velikosti 2,72 Mb ISCN: arr[GRCh37] 22q11.21(18818376_21540347)x1 Využití metod molekulární cytogenetiky Array CGH: DiGeorge syndrom del 22q11 Pomocí DNA čipů zjistíme i velikost mikrodelece Využití metod molekulární cytogenetiky mikrodeleční syndromy : Prader Willi a Angelman syndrom del 15q11-13 Metody pro stanovení diagnózy PWS a AS Cytogenetické : karyotyp - translokace Molekulárně cytogenetické : FISH - mikrodelece 15q11-13 DNA sonda MLPA, array-CGH Molekulárně genetické: PCR - uniparentální disomie, Metylační analýza Využití metod molekulární cytogenetiky Genetické příčiny vzniku PWS a AS nPrader-Williho syndrom n n n1. Delece na paternálním n chromozómu 15 n (70%) n n2. Maternální uniparentální n disomie chromozómu 15 (20 - 25 %) n n3. Změna imprintingu n (2 - 4 %) n n4. Různé chromozomální n přestavby n ( méně než 5 %) n Angelmanův syndrom n n n1. Delece na maternálním n chromozómu 15 n (70 %) n n2. Paternální uniparentální disomie chromozómu 15 n (4 %) n n3. Změna imprintingu n (1 %) n n4. Různé chromozomální přestavby n (2 %) n n5. Mutace v genu UBE 3A n (3 - 5 %) n n Prader-Williho syndrom Chaloupková nHlavní klinické příznaky: n §Snížená aktivita plodu §Neprospívání kojenců §Hypotonie novorozenců (do 9 měs.) §Obesita §Hyperfagie, neukojitelný hlad §Hypogenitalismus, hypogonadismus §PMR §Malá postava §Akromikrie §Hypopigmentace §Problémy s chováním n Angelmanův syndrom – „Happy Puppet“ Výskyt : frekvence není přesně známá – - odhad asi 1: 15 000- 1: 30 000 Kubíková n Hlavní klinické příznaky §Vážná PMR §Tuhá nemotorná chůze §Trhavé pohyby, špatná rovnováha §Absence řeči §Šilhání §Výbuchy smíchu, šťastná povaha §Hypotonie §Epilepsie §Abnormální tvar lebky §Hypopigmentace § Využití metod molekulární cytogenetiky mikrodeleční syndrom: Williams-Beurenův syndrom del7q1123 nautozomálně dominantní onemocnění s variabilní expresivitou, výskyt zpravidla de novo nriziko stejného postižení je pro děti probanda 50% nvýskyt 1:20 000 živě narozených dětí npříčina vzniku: del (7)(q11.23), deletovaná oblast o velikosti kolem 1,5 Mb zahrnuje nejméně 17 genů, nejvýznamnější je ELN gen kódující elastin ndetekce: FISH DNA sonda n Vysis ELN 7q11.23 SO/7q31 SG nMLPA, aCGH n n profil array-CGH s mikrodelecí 7q11.23 n„skřítkovitý obličej“ – široké čelo, nízký kořen nosu, krátké oční štěrbiny, velká ústa, malá brada nmalá, drobná postava, mikrocefalie nvadný skus, chybné postavení zubů, hypoplastické zuby nlehké až středně těžké duševní postižení (IQ mezi 35-70) nVCC- cévní stenózy nhyperkalcemie npřátelská povaha, hyperaktivita, hrubý hlas obr6-interfáze obr2a FISH §Telomery - fyzické konce chromozomů § §úplné konce tvořeny proteiny a tandemovými repeticemi DNA (TTAGGG) 3-20 kb (společné pro všechny chromozomy) § §TAR – doprovodné repetitivní sekvence subtelomerické oblasti 100-300 kb § Využití metod molekulární cytogenetiky Přestavby subtelomerických oblastí (delece/ duplikace) §subtelomerické oblasti na chromozomech – největší hustota genů v genomu! §aberace v této oblasti - příčina spontánních abortů, VVV a mentálních retardací §nebalancované translokace mohou být také příčinou subtelomerických přestaveb § §7 % pacientů s dysmorfií a MR - mikrodelece subtelomerických oblastí chromozomů !!! § §příklady: §Wolf-Hirschhornův syndrom (4p-), §1p36 syndrom, §Cri-du-chat syndrom (5p-), § 9p- syndrom, §13q- syndrom, §18p- syndrom § § Využití metod molekulární cytogenetiky Delece/ duplikace subtelomerických oblastí dicentr TEL4P Využití metod molekulární cytogenetiky Syndrom kočičího křiku (Cri du chat - delece 5p- ) n1 : 15 000- 50 000 n5 – 40 Mb nrůzný rozsah delece n- del 5p15.2 až celé p rameno n78 % terminální delece n10 – 15 % potomci přenašečů translokace ntypický křik novorozence nlaryngomalacie nkulatá hlava nmikrocefalie nPMR, srdeční vady nepicanthi nhypotonie 5p-k k2c_deletion lejeune1 J. Lejeune Využití metod molekulární cytogenetiky Identifikace markerových chromozomů n„supernumerary marker chromosome“, markerový chromozom či jen marker; nje to malý nadbytečný chromozom, který není možno analyzovat cytogenetickými pruhovacími metodami; nvýskyt - 1/4000 u novorozenců, n 1/2500 u amniocentéz; n 15foto FOT26-3 Philadelphský chromozóm translokace BCR/ABL ( 9q34/22q11.2) Využití metod molekulární cytogenetiky onkocytogenetika (příklad reciproké translokace) Chronická myeloidní leukemie (CML) Využití metod molekulární cytogenetiky Chronická myeloidní leukemie (CML) n nPh obvykle přítomen ve 100% mitóz v době diagnózy, přítomen i v průběhu onemocnění nnejlepší prognózu mají pacienti, kteří mají v době diagnozy Ph chromozom jako jedinou změnu nv době diagnozy u některých nemocných kromě Ph další chromozómové změny, jejich výskyt je nepříznivý prognostický znak nFISH detekujeme přestavbu BCR/ABL, specifická sonda umožňuje vyšetřovat i interfázní jádra n n https://euc-powerpoint.officeapps.live.com/pods/GetClipboardImage.ashx?Id=63c04a11-0c78-4154-afc9-7 bb162f1e655&DC=GEU4&wdoverrides=GetClipboardImageEnabled:true ¨Cytogenetika: kultivace tkáně tumoru; vyšetření karyotypu ¨ ¨Molekulární cytogenetika: ¨ I –FISH: amp.MYCN genu 2p24 del 1p36 gain 17q ¨ array-CGH ¨ SKY, MLPA ¨ Molekulární genetika: tyrozinhydroxyláza, protein PGP 9.5 Využití metod molekulární cytogenetiky u solidních nádorů : Neuroblastom(mimo jiné..) DM III. Využití metod molekulární cytogenetiky v klinické genetice dle Cílené metody : -FISH -MLPA Screeningové metody: -MLPA -Array CGH -M-FISH a SKY