Katedra laboratorních metod Bakalářské studium – Laboratorní diagnostika ve zdravotnictví LF MU Klinická biochemie – cvičení Praktické cvičení č.1 datum:__________ jméno:______________________ Okruhy k nastudování a dotazy: 1) Přečtěte si protokol a přiložený příbalový leták 2) Zopakujte si základy spektrofotometrie včetně složení spektrofotometru. 3) Osvěžte si základy vážení, rozpouštění, pipetování a k tomu potřebné výpočty. 4) Jaký je rozdíl mezi kalibrační a absorpční křivkou? 5) Z absorbance které látky vyhodnocujeme v tomto stanovení koncentraci glukózy? 6) Jaký je rozdíl mezi viditelnou a komplementární barvou? Jakou vlnovou délku absorpčního maxima (přibližně) bude mít červeně se jevící roztok? Téma praktika: 1a) Absorpční spektrum barevného produktu reakce (glukóza) Stanovení absorpčního maxima Přístroje a pomůcky: Spektrofotometr DU – 65 Spectrophotometr Beckman/ Spekol Stojánky, zkumavky, mikropipety, dávkovače, špičky, standardní roztok glukózy, souprava Glukosa GOD-PAP, Roche Diagnostic Úkoly: Ze standardů 5 a 10 mmol Glu/l připravte vzorky pro analýzu o objemu kolem 0,5 ml a koncentracích 2,5 5,0 10,0 mmol/l. 1) Zpracujte blank a naředěné vzorky tak, že smícháte 20 ml jednotlivých standardů (pro blank 20 ul vody) a 2,00 ml činidla ze soupravy. Reakční směs nechejte inkubovat 10 min 2) Manuální proměření absorpčního spektra a stanovení absorpčního maxima: u jednotlivých vzorků proměřte absorpční spektrum po 20 nm v rozmezí vlnových délek 410 – 660 nm (každá skupina změří jeden vzorek a výsledky poskytne kolegům). 3) Výsledky měření zaznamenejte do tabulky. Sestrojte graf (absorpční spektrum) a z grafu stanovte absorpční maximum produktu stanovení glukózy. l (nm) A (pro c=2,5 mmol/l) l (nm) A (pro c=5,0 mmol/l) l (nm) A (pro c=10 mmol/l) 410 410 410 450 450 450 480 480 480 490 490 490 500 500 500 510 510 510 520 520 520 560 560 560 600 600 600 660 660 660 4) Proveďte plně automatické proměření absorpčního spektra v daném rozmezí vlnových délek pomocí funkce Scan, vytiskněte graf absorpčního spektra a výsledky manuálního i automatického měření porovnejte. Závěr: Praktické cvičení č.1b datum:__________ jméno:______________________ 1b) Téma praktika: Vliv vlnové délky na měřící rozsah Přístroje a pomůcky: Spektrofotometr DU – 65 Spectrophotometr Beckman Stojánky, zkumavky, mikropipety, dávkovače, špičky souprava Glukosa GOD-PAP, Roche Diagnostic, glukosa k přípravě standardního roztoku Úkoly: 1) Připravte 200 ml roztoku glukózy o c=50,0 mmol/l, M (glu) =180,16 2) Připravte kalibrační standardy o objemu 0,5 ml a koncentracích 2,5 5,0 7,5 10,0 15,0 20,0 30,0 50,0 mmol/l ředěním standardního roztoku glukózy o c = 50,0 mmol/l Tabulka ředění: Standard č. 1 2 3 4 5 6 7 8 c (mmol/l) 2,5 5,0 7,5 10,0 15,0 20,0 30,0 50,0 st.r.50 (ml) Dest.H[2]O(ml) 3) Současně zpracujte blank a naředěné standardy tak, že smícháte 20 ml standardního roztoku (do blanku 20 ml destilované vody) a 2,00 ml činidla ze soupravy. Reakční směs nechejte inkubovat 10 minut bez přístupu přímého slunečního světla. 4) Měření proveďte při vlnových délkách 380, 500 a 600 nm proti blanku. 5) Výsledky měření zaznamenejte do tabulky. Standard [mmol/l] A l410 nm Standard [mmol/l] A l500 nm Standard [mmol/l] A l600 nm 0 0 0 2,5 2,5 2,5 5,0 5,0 5,0 7,5 7,5 7,5 10,0 10,0 10,0 15,0 15,0 15,0 20,0 20,0 20,0 30,0 30,0 30,0 50,0 50,0 50,0 6) Na milimetrovém papíru sestrojte kalibrační graf s jednotlivými kalibračními křivkami a určete při které vlnové délce má metoda nejvyšší citlivost a která vlnová délka je nejvhodnější pro měření. Zdůvodněte a srovnejte s hodnotou vlnové délky, při které probíhá měření dle příbalového letáku této metody. 7) Závěr: