Základy cytologie likvoru David Zeman 2023 Kvantitativní cytologické vyšetření likvoru Fuchs - Rosenthalova komůrka Objem 3,2 jlíI Jaderné buňky barvíme (např. roztokem fuchsinu v kyselině octové, popř. roztokem methylvioleti nebo toluidinové modři) Ery počítáme v „nativním" (nebarveném) likvoru Orientační diferenciace (nejlépe jen mononukleáry/ polymorfonukleáry) Normocytóza <4/jli1 Pleocytóza >4/ul Spotřeba vzorku: 0,12 ml (v nouzi stačí 0,06 ml) 1 [ 11 11 L.H — 5 íiefe Depth Pfofondeut 0.0625 mm2 RUM W ^EAMAKI' Korekce na ery provádí (si) lékař, nikoliv laboratoř! Klasický vzorec (nutno dosadit ve stejných jednotkách!) CSF - ery x krev - leuko CSF - leukokoňg. = CSF - leuko měř. - krev - ery Dětská hematoonkologie (studie) - fyziologicky je CSF - leuko _ krev - leuko -<2x- CSF - ery krev - ery Kvalitativní cytologické vyšetření Příprava preparátu - cytosedimentační metoda Různé modifikace Saykovy metody Zde: komůrka podle Němečkově (firma Mikropur, Hradec Králové) Sedimentace buněk a gravitační přítlačná síla Dlouhá životnost v Šetrnost (výtečné zachování morfologie buněk) Doba sedimentace cca 20 minut Cena cca 8 000 Kč Spotřeba vzorku: 0,25-0,35 ml (přes 1 filtrační papír) Kvalitativní cytologické vyšetření Příprava preparátu - cytocentrifugační metoda Cytocentrifuga (zde: Cytofuge 2 firmy StatSpin) Volitelná rychlost a čas centrifugace, 3 druhy cytocentrifugačních komůrek Používáme nízké otáčky, krátký čas (600/min = 20 x g, 4 minuty) výtečné zachování morfologie buněk Paralelní příprava až 4 preparátů Cena cca 50 000 - 80 000 Kč Spotřeba vzorku: 0,1-0,2 ml 5 Kvalitativní cytologické vyšetření • Základní barvení: • May-Grunwald-Giemsa • Alternativa (rychlejší): Diff-Quik (Medion Diagnostics) - Fixační Fast green v methanolu - Eosin G ve fosfátovém pufru - Thiazin ve fosfátovém pufru • RAL Diff-Quik (RAL Diagnostics), Hemacolor® {Merck) • Speciální barvení: - Gramovo barvení (baktérie) - Průkaz Fe3+ (berlínská modř) - Průkaz lipidů (olejová červeň, sudanová čerň) - Průkaz mukopolysacharidů a glykogenu (PAS, PAS/alcián) - ... a mnoho jiných - Imunocytochemická barvení 6 Preanalytika • Zkumavky bez protisrážlivých činidel, bez akcelerátorů srážení!!! (obvyklá chyba: zkumavka z krastenem po jeho „vysypání" ze zkumavky) • Počítání jaderných buněk a ery: do 2 (max. 3) hodin po odběru • Příprava preparátu: optimálně do 2 hodin po odběru; zkušenost však ukazuje, že prodleva nepřesahující 4-6 hodin nevede k výraznější alteraci nálezu • Připravený preparát vydrží i bez použití chemické fixace několik dnů • V případě pozdního zpracování vzorkuje třeba na výsledkový list do poznámky uvést datum a čas odběru, jak je uvedené na žádance • V případě opožděné přípravy preparátu popisujeme preparáty bez závěru (nejsou-li zachyceny jednoznačně diagnostické změny, např. nádorové buňky, siderofágy apod.) • Nedodrženipreanalytických podmínek NEOPRAVŇUJE k odmítnutí vzorku - jde o VZÁCNÝ MATERIÁL, odběr nelze jednoduše opakovat!!! Fyziologický cytologický likvorový nález • <12/3 (<4/ul) buněk ve Fuchs-Rosenthalově komůrce; žádné polymorfonukleáry • Novorozenci a kojenci do věku 3 měsíců: <10 buněk/ul, mohou být ojedinělé polymorfonukleáry • Cytologický preparát: „klidové" lymfocyty a monocyty (v poměru 1:1 až cca 9:1; jejich vzájemné zastoupení závisí i na způsobu přípravy preparátu, místu odběru a množství vzorku), popř. ojedinělé buňky výstelky • POZOR ! I v normálním likvoru lze pozorovat: • ojedinělé „aktivované" formy lymfocytů a monocytů • ojedinělé erythrocyty • Zcela ojedinělé (1-3 na preparát) neutrofilní granulocyty MONONUKLEARY obr. vlevo: lymfocyt (šipka), ery obr. vpravo: monocyt (dole vlevo),lymfocyt (nahoře vpravo),ery Monocyty klidové (vlevo); aktivované (vpravo) Buňky výstelky likvorových cest Buňky výstelky likvorových cest Patologické likvorové cytologické nálezy • Pleocytóza - zvýšení počtu („koncentrace") buněk • Patologická oligocytóza (nebo: normo cytóza): normálni počet buněk, abnormní buněčné složení • Modifikovaná klasifikace dle Adama: - lymfocytární - monocytární - smíšená mononukleární (lymfocyty + monocyty) - granulocytární - smíšená (mononukleáry + polymorfonukleáry) - „tumorózní" (nádorové buňky) Obvyklé cytologické likvorové nálezy u skupin onemocnení • Hnisavé neuroinfekce - granulocytární (neutrofilní) pleocytóza (tisíce až desetitisíce buněk/ul) • Nehnisavé neuroinfekce - zprvu smíšená, od 3.-5. dne lymfocytární pleocytóza (stovky max. nižší tisíce buněk/ul), často s plazmocytární reakcí • Roztroušená skleróza - lymfocytární normocytóza nebo mírná pleocytóza (do 50 buněk/ul), často s plazmocytární reakcí • Polyradikuloneuritis Guillain-Barré - cytologický likvorový nález bez hrubší patologie (může být mírná mononukleární pleocytóza nejvýše do 20 buněk/ul v 1. týdnu onemocnění) ve spojení s těžkou bariérovou poruchou (ŤŤQ-Alb) • Krvácení do likvorových cest - v úvodu neutrofilní, později smíšená (monocyty/makrofágy + neutrofily) pleocytóza (stovky až tisíce buněk/ul i po korekci na množství ery), rychle nástup fagocytární reakce: fagocytóza ery (po 4-12 hodinách), hemosiderin (od 3. dne), hematoidin (od druhého týdne) • Maligní infiltrace mening: nádorové buňky v preparátu (počet buněk může být velmi různý, někdy i nezvýšený!) Plazmatické buňky Nehnisavé neuroinfekce Klíšťová meningo encefalitida 1. LP (13. 6. 2000): CSF lehce zkal, po centrif. čb 906/3 elem, 80/3 ery, CB 0.91 g/l, glukóza 4.25 mmol/1, laktát 1.95 mmol/1 Kontrolní LP (10. 7. 2000): CSF čb, 167/3 elem, 5/3 ery, CB 0.55 g/l, glukóza 2.9 mmol/1, Q-Alb 7.2, i.th. IgG 43% (38 mg/l), i.th. IgM 94% (91 mg/l), i.th. IgA 0% Nehnisavé neuroinfekce Neuroborrelióza Muž 64 let, meningo-polyradikuloneuritický sy. CSF: čb, 728/3 elem, 2/3 ery, cytologie: lymfo 88%, plazmo 7%, mono 4.5%, neu 0.5% CB 1.26 g/l, glukóza 4.2 mmol/1, laktát2.3 mmol/1, Q-Alb 19.2, i.th. IgG 30% (78 mg/l), i.th. IgM 63% (16 mg/l), i.th. IgA 0%, fKLC-index 7, oligo-f kLC pozitivní. Neuroborrelióza lymfocytární pleocytóza s plazmocytární reakcí Likvor čirý, bezbarvý 434/3 elem (324/3 lymfo, 8/3 plazmo, 90/3 mono, 12/3 segm) Preparát: lymfo 85 %, plazmo 2 %, mono 11 %, neutrof.segm.2 % Pandy 3, krev 0 CB 1,911 g/l Glukosa 3,96 mmol/1 Laktát 3,36 mmol/1 Q-Alb 29,97x 10"3 ith. syntéza IgG (30 %) a IgM (54 %) IgG-OCB:typ3 + typ5 (koincidence MGUS) Diferenciální diagnostika Obraz nehnisavého zánětu Diferenciální diagnostika Obraz nehnisavého zánětu • Muž 45 let, kořenový sy. CSF: čb, 63/3 elem, 36/3 ery, cytologie: lymfo 36%, plazmo 4%, mono/makrofágy 45%, neutr. 14%, eos. <1%, ojed. atypické buňky CB 1.98 g/l, glukóza 2.6 mmol/1, laktát 1.5 mmol/1 Dg. dle MRI: spondylodiscitis s abscesem v intervert. prostoru a šířením flegmonózního zánětu peridurálně Diferenciální diagnostika nehnisavý zánět x meningeosis lymphomatosa/leukaemica Fagocyty vlevo: fagocyt v základním barvení, lymfocyty vpravo: erythrofág (vlevo dole od něj rozpadající se plazmocyt) Erythrofágy u čerstvého krvácení Erythrofágy u čerstvého krvácení vlevo nahoře „neorthodoxní"fagocytóza ety neutrofilním granulocytem Fagocyty s vícečetným substrátem fagocytózy vlevo: „erythrolymfofág" vpravo: erythosiderofág Fagocyty vlevo: siderofágy, nečistoty vpravo: makrofágy s krystaly hematoidinu Siderofágy v základním barvení (vlevo) a cytochemický průkaz Fe3+ (vpravo) Hemosiderin Granula hemosiderinu extracellulárně (na obr. vpravo označená šipkou), erythrocyty Hematoidin a jeho degradace v preparátu vlevo čerstvý preparát, uprostřed po 5 hodinách, vpravo po 14 dnech Hematoidin a jeho degradace v preparátu větší zvětšeni (imerze); vlevo po 5 hodinách, vpravo po 14 dnech Fagocyty vlevo: lymfofág; fagocytovaný monocyt vpravo: pěnová buňka (lipofág); průkaz lipidů olejovou červení Fagocyty buňky tvaru pečetního prstenu (signet-ring cells) Neutrofilní granulocyty 1 * VtäM^Sb neutrofily monocyt lymfocyt Neutrofilní granulocyty; kokovité baktérie (šipka) základní barvení Neutrofilní granulocyty; grampozitivní koky Gramovo barvení kultivace: Staphylococcus epidermidis Neutrofily, grampozitivní diplokoky (Streptococcus pneumoniae) Gramovo barvení (Merck) Meningitis purulenta 16-denní novorozenec ^J&;<& CSF: 36160/3 elem, ^ftffi 1580/3 6,7 ^T'iÖ? * Glukóza 3.0 mmol/1 5j*á-oV3^í Laktát 4.3 mmol/1 Kultivace: E. coli Meningitis purulenta (Haemophilus) * Dívka stáří 16 dní Sá^fř . ^ CSF: žlutý, kalný, po centr. sediment hnisu * 56144/3 elem, 112/3 ery f '% w Pandy 3, CB 2.92 g/l, glukóza 0.2 mmol/l, laktát 10.3 mmol/l S: CRP 112 mg/l (KONTROLNÍ LP po 14 dnech: 134/3 elem, 1968/3 ery, Pandy 1, CB 0.94 g/l, glukóza 1.38 mmol/1, laktát 1.81 mmol/1) Hnisavá ventrikulitida (B. cereus) Hnisavá ventrikulitida (B. cereus) 1. LP 3. 11. 2000: CSF žlutý, 3584/3 elem, 96/3 ery, CB 1.7g/l, glukóza 5.3 mmol/1, laktát 3.8 mmol/1, závěr: purulentní neuroinfekce 2. LP 5. 11. 2000: CSF hnědý, 1488/3 elem, 264/3 ery, záchyt G+ tyčí 3. LP 7. 11. 2000: CSF lakový, 5536/3 elem, 2992/3 ery, CB 18.6 g/l, glukóza 0.0 mmol/1, laktát 4.3 mmol/1 VZV meningoencefalitis smíšenápleocytóza s převahou segmentů • Likvor čirý, bezbarvý • Pandy +, krev stopy • 504/3 elem (40/3 lymfo, 28/3 plazmo, 52/3 mono, 384/3 segm.) • Preparát: lymfo 7 %, plazmo 2 %, mono 5 %, neutr. segm. 86 % Ojed. ery. • CB 0,490 g/l • Glukosa 3,70 mmol/1 • Laktát 2,37 mmol/1 Eosinofily Bakteriální infekce s absencí adekvátní buněčné odpovědi Baktérie - tyčky a koky základní barvení; vlevo velké mononukleární buňky (blíže s jistotou neurčené) Gramnegativní tyčky a grampozitivní koky Gram ovo barvení kultivace: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa (koky neuvedeny) Gramnegativní tyčky a grampozitivní koky Gram ovo barvení kultivace: Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa Mitotické figury v likvoru vlevo monocytoidní, uprostřed a vpravo lymfoidní buňky uprostřed: mitózy v zánětlivých likvorech vpravo dole: mitóza u pacientky s infiltrací mening NHL Nediferencované mononukleární buňky Kontaminace II Chondrocyty Kontaminace III. Kostní dřeň nezralé buňky všech (!) řad hematopoezy Kontaminace III. Kostní dřeň nezralé formy myelopoezy Kontaminace III. Kostní dřeň (NEBO: periferní krev abnormního složení) vlevo: monocyt, metamyelocyt; vpravo: neutrofilní tyčky Kontaminace III. Kostní dřeň bazofilní (vlevo), orthochromní (uprostřed) a acidofilní (vpravo) normoblasty Artefakty: narušené lymfocyty v silně buněčných preparátech (nezaměňovat za kvasinky !!!) Kryptokoky ve F.-R. komůrce Kryptokoky základní (vlevo) a Gramovo (vpravo) barvení Nádorová infiltrace mening NHL (non-hodgkinsky lymfom) Nádorová infiltrace mening - NHL (jiný případ) vs. lymfocytární pleocytóza u nehnisavého zánětu Kviz: který snímek patří ke které diagnóze ? Nádorová infiltrace mening čb, 4032/3 atypických bb., Pandy ++, krev 0 • CB 1,478 g/l, glukosa 0,09 mmol/1 • laktát 12,15 mmol/1 cytologie: min. 78 % atypických bb. lymfoidního vzhledu, 15 % lymfo (některé též atyp), 6 % mono, 2 % neutr. - obraz v.s. maligní infiltrace plen • Dg.: B-NHL Nádorová infiltrace mening (B-NHL) vlevo mitotická figura Děti s akutní lymfoblastickou leukémií (ALL): „Neurostatus" záchyt blastů většinou na vrub krevní kontaminace ALL - CNS status definice dle studie AIEOP-BFM ALL 2008 • CNS 1: nejsou klinické známky CNS onemocnění, nejsou známky CNS onemocnění na zobrazovacích metodách, absence blastů v likvoru (cytospinový preparát) bez ohledu na počet leukocytu • CNS 2: nejsou přítomny klinické známky CNS onemocnění, nejsou známky CNS onemocnění na zobrazovacích metodách, - CNS 2a: <10/uL ERY, <5/uL LEUKO, pozitivní nález blastů - CNS 2b: makroskopická kontaminace krví a/nebo >10/uL ERY; <5/uL LEUKO, pozitivní nález blastů - CNS 2c: makroskopická kontaminace krví a/nebo >10/uL ERY, >5/uL LEUKO, pozitivní nález blastů, ale negativní algoritmus pro vyhodnocení traumatické kontaminace iniciální LP • CNS 3: - CNS 3a: ERY <10/uL, LEUKO >5/uL, pozitivní nález blastů CNS 3b: ERY >10/uL, LEUKO >5/uL, pozitivní algoritmus pro vyhodnocení traumatické kontaminace iniciální LP CNS 3c: klinické příznaky CNS onemocnění nebo příznaky CNS onemocnění na zobrazovacích metodách Infiltrace CNS u AML (vlevo: Diff-Quik; vpravo: průkaz myeloperoxidasy, Auerovy tyče) Karcinóza mening (Ca plic) buňka tvaru pečetního prstenu (signet ring cell, Siegelringzelle) - srv. snímek 32! Nádorová infiltrace mening (Ca mammae) vlevo nádorové buňky, mitotická figura; vpravo dva monocyty Nádorová infiltrace mening Ca mammae Nádorová infiltrace mening Ca mammae Proč cytologický preparát u pozdě dodaných vzorků ? (problematická preanalytika) Proč cytologický preparát u pozdě dodaných vzorků? • Q-Alb 290,9* 10A-3, intrathek. syntéza IgG, IgA ani IgM výpočtem neprokázána, IgG-OCB 2/2 typ 4 • Cytologický preparát: lymfo 12 %, mono 21 %, neutr. 64 %, eos. 1/3 poloměru jádra) 41% 0% Indentace v jádře 82% 48% Jadérka 64% 36% Nepřínosné znaky (P>0,01) Vakuoly v cytoplazmě 64% 71% Bazofilní cytoplazma 100% 100% Mitózy 53% 32% Jádroplazmový poměr 0,72 0,79 Jádro tvaru jetelového lístku 29% 32% Význam průtokové cytometrie v diferenciální diagnostice nejasných cytologických nálezů recidivující hydrocefalus nejasné etiologie, 3 elementy/uL preparát ze sedimentu po předcentrifugaci Význam průtokové cytometric v diferenciální diagnostice nejasných cytologických nálezů Neuroborrelióza (myelitis) Susp, primární lymfom CNS KAPPA-FITC KAPPA-FITC Imunologické charakteristiky lymfomových buněk zčásti podle Tumani H, Petereit HF (Eds): Lumbalpunktion und Liquordiagnostik. Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie. 2019. www.dgn.org Převaha B lymfocytů (v normálních likvorech 0-3%; uRS <10%; u neuroborreliózy <25%) Výrazně abnormní poměr CD4/CD8 („IŘI") Vysoký podíl CD4+ CD8+ lymfocytů Restrikce najeden typ lehkého řetězce (monoklonalita), popř. chybění lehkých řetězců někdy intrathekální syntéza IgM Ztráta normálně exprimovaných antigénu (např. CD7, CD5) Koexprese nezralých nebo aberantních antigénu na/v B lymfocytech (např. CD34, CD10, CD30, TdT, CD5) Koexprese nezralých nebo aberantních antigénu na/v T lymfocytech (např. CD34, CD 10, CD30, CD la) Klasifikace cytologických nálezů vzhledem k diagnostice nádorové infiltrace CNS (Ballester et al. JNeuropahtolExp Neurol 2018; 77: 628-35) Negativní Atypické buňky - abnormální morfologie, ale nevzbuzuje podezření na malignitu (ve studii hodnoceno jako negativní) Suspektní - buňky s atypiemi cytomorfologicky suspektními z malignity, ale kvantitativně nebo kvalitativně nedostačujícími pro hodnocení jako pozitivní (ve studii hodnoceno jako pozitivní) • Pozitivní CAVE! Termíny „atypické" a „suspektní" používají různí cytologové (likvoru) v různém významu Některá klinická doporučení shrnují „atypické" a „suspektní" nálezy do kategorie „nejednoznačné" či „nekonkluzivní" („equivocal") s konsekvencemi pro stupeň pravděpodobnosti diagnózy i hodnocení Odpovědi na léčbu! (Le Rhun et al. Ann Oncol 2017; 28, Suppl 4: iv84-99) U atypických a suspektních nálezů je třeba usilovat o imunocytologické vyšetření (Dušková a Sobek, BrainBehav 2017; 7: e00805) k upřesnění klasifikace Kvíz na závěr: Neznámý útvar v preparátu Pylové zrno v preparátu čeleď Asteraceae (sedmikrásky), rod Bidens (dvouzubec) určeno v Botanickém ústavu AV ČR v Průhonicích laskavostí doc. Dr. O. Rybníčka a dr. E. Krause Děkuji za pozornost Preparát s pylovým zrnem - zaostřeno na buňky