Lékařská mikrobiologie pro ZDRL Týden 12 Neutralizační reakce, reakce se značenými složkami 2 A ještě trochu opakování: Interpretace •Průkaz antigenu (včetně antigenní analýzy) je přímá metoda. Pozitivní výsledek znamená přítomnost mikroba v.těle pacienta •Průkaz protilátek: je to nepřímá metoda. Nicméně jsou způsoby, jak alespoň odhadnout, kdy přibližně se mikrob s.tělem pacienta setkal: –Množství protilátek (titr) a hlavně jeho změna –Třída protilátek: IgM/IgG –Avidita protilátek – síla vazby na antigen 3 Jak tyto informace zjistit •Čerstvá infekce: velké množství protilátek, převážně třídy IgM, případně i IgA •Pacient po prodělané infekci: malá množství protilátek, hlavně IgG (imunologická paměť) IgM a IgG 1 1 2 2 4 Typy serologických reakcí a jejich způsoby využití Průkaz antigenu Antigenní analýza Nepřímý průkaz Aglutinace občas často někdy Precipitace málokdy málokdy občas KFR často (viry) ne často (viry) Neutralizace občas ne často Značené složky velmi často výjimečně velmi často 5 Neutralizace •Klasické, ale stále používané reakce •Napodobují přirozenou funkci protilátek (protilátky blokují cytopatický či „erytrocytopatický“ efekt viru či toxinu) •Hodí se jen u některých infekcí (virové infekce, infekce toxickými bakteriemi) •Princip je jednodušší než u KFR 6 Neutralizační reakce: obecný princip •Protilátky fungují několika způsoby. Jeden z nich je přímá neutralizace. •Tento způsob se zřídka vidí u celých bakterií. Pozorujeme ho u virů nebo bakteriálních toxinů •Nicméně někdy protilátky neutralizují i určitou charakteristiku celé bakterie, např. pohyblivost Treponema pallidum u tzv. Nelsonova testu (TPIT). 7 Příklady neutralizačních reakcí Úkol Neutralizován Objekt Reakce 1 Toxin bakterie (hemolyzin) Erytrocyt hemolýza ASLO 2 Virus Erytrocyt shlukování HIT 3 Virus Buňka efekt metabolický VNT 8 Příklad 1: ASLO •Protilátka (ANTISTREPTOLYZIN O) blokuje hemolytický efekt toxinu (streptolyzinu O) na krvinku. •ASLO není nepřímý průkaz, přestože hledáme protilátky. Nepátráme tu po patogenovi, určujeme samotné protilátky, jež mohou být nebezpečné •U ASLO neužíváme geometrickou řadu. Hodnoty ředění jsou speciální. •Titr nad cca 200 mezinárodních jednotek znamená možnost autoimunitní odpovědi 9 Proč se dělá ASLO •Pomocí testu ASLO zjistíme, zda je přítomna normální protilátková odpověď, nebo přemrštěná automimunita s rizikem vývoje glomerulonefritidy nebo revmatické horečky •Test ASLO se provádí zpravidla po prodělané streptokokové infekci. Průkazem protilátky se nesnažíme prokázat infekci (o té víme), ale zjistit, zda dochází k vývoji autoimunity. Je to tedy zvláštní případ, kdy vlastně nejde o nepřímý průkaz infekce, přestože prokazujeme protilátky. 10 Hodnocení ASLO •Panel se odečítá naležato. První řádek prvního panelu je pozitivní kontrola, dále má každý pacient jeden řádek •Nejvyšší ředění se zábranou hemolýzy (pozitivní reakce, projeví se sedimentací erytrocytů) je titr •Titry cca 225–270 jsou hraniční, vyšší jsou pozitivní, nižší jsou negativní. Úplná absence protilátek znamená, že se pacient se streptokokovou infekcí nesetkal Jamka č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hodnota m. j. 100 120 150 180 220 270 337 405 506 607 759 911 11 Příklad 2: HIT •Hemaglutinačně Inhibiční Test •Pozor, tohle NENÍ aglutinace, je to druh neutralizace! •Protilátka neutralizuje virové shlukování krvinek (in vitro vlastnost většiny virů) •Pozitivní reakce = zábrana virového shluknutí à erytrocyty klesají na dno důlku •Negativní reakce = viry se shluknou •Vypadá to jako hemaglutinace naruby 12 Příklad 3: VNT (nepleťte si to s TNT J ) •Virus Neutralizační Test •Viry lze pěstovat na buněčných kulturách. Jsou to buněčné linie většinou embryonálních či nádorových buněk •Buněčná kultura bývá poškozena účinkem virů. Škodu můžeme pozorovat např. jako –změnu morfologie buněk v kultuře –změnu metabolismu à změna pH à změna zbarvení v důlku (při použití indikátoru) •Jsou-li přítomny protilátky, mohou tomuto vlivu na buňky zabránit 13 Ukázka vyhodnocení VNT •V pravém sloupci jsou různé kontroly, jinak žluté důlky ukazují pozitivitu a červené negativitu. V prvním dvojřádku máme pacienta se stálým, nízkým titrem. V dalším dvojřádku je pacient, jehož titr se čtyřikrát zvýšil. Další pacient se s infekcí nikdy nesetkal. Poslední dvojřádek ukazuje pacienta se sérokonverzí. colortest 14 Průběh protilátkové odpovědi – opakování •Protilátky IgM se tvoří jako první, ale také jako první mizí. Neprocházejí placentou, jejich průkaz u novorozence je svědectvím jeho infekce •Protilátky IgG se tvoří později a zůstávají jako paměťové přítomny dlouhodobě. Procházejí placentou IgM a IgG (novorozenec je tedy může mít od matky) 15 Protilátky ostatních tříd •Protilátky třídy IgA se u některých infekcí vyšetřují místo protilátek IgM. Tato třída se uplatňuje hlavně u slizniční imunity, a tedy u infekcí, kde branou vstupu je sliznice (například gastrointestinální) •Protilátky třídy IgE se vyskytují u alergií a infestací červy. Zpravidla se však nestanovují specifické IgE proti nějakému patogenovi •S protilátkami IgD se v mikrobiologii nepracuje 16 Reakce se značenými složkami •Na povrch se postupně navazují jednotlivé složky •Místo jedné ze složek se pokusíme navázat vzorek od pacienta, o kterém si myslíme, že danou složku možná obsahuje •Je-li to pravda, složka se naváže •Pokud se všechny složky postupně navážou, vznikne nepřerušený řetězec •Na konci řetězce je vhodné značidlo 17 Promytí a jeho význam •Pokud by v reakci zůstalo přítomno i to, co se na nic nenavázalo, nedokázali bychom odlišit pozitivní reakci od negativní •Proto po každém kroku reakce následuje promytí, po kterém zůstanou přítomny pouze složky navázané na pevný povrch •Je-li řetězec přerušen, odplaví promytí vše za místem přerušení 18 Příklad pozitivního a negativního průběhu Laboratorní protilátka Hledaný antigen Antigen chybí Značená laboratorní protilátka (àdetekce) Značená laboratorní protilátka + – Není navázaná à je odplavena à nemůže být detekována POVRCH (sklíčko nebo dno důlku v destičce pro serologii) Pacientův vzorek Laboratorní protilátka 19 Typy značidel •Fluorescenční barvivo je značidlem u imunofluorescence •Radioizotop je značidlem u reakce RIA •Enzym je značidlem u reakce EIA/ELISA –Western blotting je zvláštním případem reakce ELISA, kde jednotlivé antigeny jsou elektroforeticky rozděleny •Chemiluminofor chemiluminiscenční reakce CLIA/CMIA v analyzátoru • •Používáme-li jako značidlo enzym, je poslední složkou přidanou do reakce ještě příslušný substrát – tedy jeden krok navíc. 20 07 22b www.biologie.uni-hamburg.de Imunofluorescence Foto DVH 21 Imunofluorescence 08 immunofluorescence 09 immuno4 10 ifakit www.amsbio.com www.kcl.ac.uk www.bindingsite.com 22 Imunofluorescence •Přímá imunofluorescence •(Povrch)-(antigen)-(značená protilátka) •Nepřímá imunofluorescence •(Povrch)-(antigen)-(protilátka)-(značená protilátka proti lidské protilátce) • Výhoda: Povrchem je tu podložní sklíčko. To nám umožňuje vidět tvar mikroorganismů. 23 Imunofluorescence schematicky IMF 1 a 2 A: Treponema pallidum – od pacienta B: Značená protilátka proti Treponema pallidum C: Treponema pallidum – z laboratoře D: Protilátka proti Treponema pallidum – od pacienta E: Značená protilátka proti lidské protilátce 24 C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\05 elisa_1.jpg ELISA www.genprice.com 25 ELISA C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\02 pathscan_elisa.jpg www.cellsignal.com C:\Documents and Settings\u Svate Anny\Dokumenty\Obrázky\Značené složky\04 ELISA.jpg virology-online.com ELISA 26 https://vydavatelstvi-old.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/elisa.html 27 Význam konjugátu •Konjugát se používá zpravidla u reakcí nepřímého průkazu (průkaz protilátek) •Je to protilátka, pro kterou je antigenem lidská protilátka např. IgM nebo IgG •Dokáže být selektivní proti určité třídě lidské protilátky •Použití konjugátu je tedy podstatou možnosti selektivního průkazu jednotlivých tříd protilátek 28 Možnosti uspořádání složek bleděmodře vždy složka pocházející ze vzorku získaného od pacienta •Povrch-antigen-protilátka-značidlo (P) •Povrch-protilátka-antigen-protilátka-značidlo (P, např. průkaz HBsAg) •Povrch-antigen-protilátka-antigen-značidlo (N) •Povrch-antigen-protilátka-konjugát-značidlo (N) •Konjugát je protilátka namířená proti lidské protilátce 29 ELISA – praktické provedení •Zpravidla máme k dispozici destičku s.jamkami. Na rozdíl od klasických serologických reakcí má každý pacient nikoli celý řádek, ale jen jeden důlek. To proto, že nezjišťujeme titry •Před vlastními důlky pacientů mohou být důlky: –Bl – blank (pro kalibraci spektrofotometru) –K- a K+ – pozitivní a negativní kontrola –Cut off (dva či tři důlky) – výrobcem dodané „vzorky“ s.právě hraniční hodnotou absorbance („odsekávají“ pozitivní výsledky buď ostře, nebo s rozmezím plus mínus 10 %) •Vždy záleží na konkrétní reakci ELISA a jejím provedení. Někdy chybí blank, někdy není cut off přímo obsažen v.destičce, ale počítá se jako průměr negativních kontrol + konstanta. 30 ELISA – ukázka (www.medmicro.info) Foto DVH ELISA pro průkaz protilátek. Klikni! 31 ELISA, průkaz protilátek •U nepřímého průkazu reakcí ELISA se zpravidla hodnotí zvlášť protilátky IgM, IgA a IgG Foto DVH 32 ELISA •U reakce ELISA je na konci celého procesu enzymatická reakce. Její intenzita se projeví jednoduše: intenzitou zbarvení v.důlku, kde reakce probíhá. Sytá barva = vysoce pozitivní. •Nenáročnost z hlediska nákladů a nulové radiační nebezpečí je výhodou oproti radioimunoassayím •Možnost automatizace je velkou výhodou oproti imunofluorescenci 33 Western blotting •Název – slovní hříčka (badatel Southern) •Prakticky je to ELISA, ale směs antigenů je rozdělena elektroforeticky na jednotlivé antigenní determinanty •Je tedy přesnější a pomáhá zejména tam, kde klasická ELISA troskotá na zkřížené pozitivitě např. příbuzných mikroorganismů 34 Western blotting – princip •1: původní antigen (směs) •2: uvolnění jednotlivých antigenů detergentem •3: elektroforetické rozdělení antigenů •4: „přesátí“ rozdělených antigenů na nitrocelulózu •5: reakce ELISA (přítomny jsou jen některé protilátky) Western blotting 35 Imunoblot Foto DVH 36 Western blot - ukázky Foto DVH 37 Western blot výsledný protokol Foto DVH Microblotarray Foto DVH Chemiluminisceční metody (imunoanalýza) •Značidlem je chemiluminofor •Dochází k vyzáření světla, které je následně detekováno •Běžně se tato metoda užívá v modifikaci CMIA (Chemiluminiscent Microparticle Immunoassay) •Antigen nebo protilátka jsou navázána na paramagnetické částice • •měří se vyzářené světelné kvantum v relativních světelných jednotkách (RLU) • 40 Imunochromatografické testy •Imunochromatografické testy jsou založeny na navazování jednotlivých komponent podobně jako předchozí •Důležitým rozdílem je, že zde není promytí. Některé komponenty jsou navázány na povrch na určitých místech (testovací a kontrolní místo), další se hned naváží na testovanou složku a spolu s ní cestují porézní vrstvou. V pozitivním případě je zpravidla pozorován proužek u testu i u kontroly, v negativním jen u kontroly. 41 Ukázky imunochromatografických testů Foto DVH 42 Imunochromatografické testy: výhody •Jsou velmi rychlé (desítky minut) •Jsou velmi jednoduché à některé se nedělají v laboratoři, ale přímo u pacienta •Jsou dostatečně přesné? •Mohou být použity pro mnoho účelů (včetně mimomikrobiologických, například těhotenský test) •POCT •Nevýhoda: jsou poměrně drahé ve srovnání s tradičními testy 43 Přeji Vám hezký zbytek dne… www.twitchfilm.net/archives/ 003401.html