Mgr. Jana Tylečková TTO FN Brno Imunohematologie Obecná imunohematologie — —Imunologie aplikovaná na krevní buňky (erytrocyty, granulocyty, lymfocyty, trombocyty) —Nauka o antigenech, protilátkách, imunitních reakcích, klinicky využívaná při přípravě a podání transfuze a u některých jiných stavů —Řeší specifickou imunohematologickou problematiku (hemolytické onemocnění novorozence, autoimunitní hemolytické anemie, potransfuzní reakce, uplatnění v transplantologii) Imunita —Obecná definice: odolnost proti nemocem, antigenům —Zajišťuje ji systém buněk, tkání a molekul, tzv. imunitní systém —Dva typy imunity: —Přirozená (nespecifická) -Okamžitá reakce, brání vstupu aloantigenů do organizmu, rychle je eliminuje (první linie obrany). oNeporušený epitel (jeho enzymy, mikroflóra) oHumorální složka (komplement, cytokiny, interferony) oBuněčná složka (fagocyty, NK buňky) —Získaná (specifická, adaptivní) - Pomalejší, ale specifická a více efektivní obrana (stimulují ji antigeny, které pronikly do tkání; rozpoznání antigenu v lymfatických orgánech) oHumorální složka (protilátky tvořené B lymfocyty, eliminují mikroby z extracelulárních tekutin) oBuněčná složka (T lymfocyty, CD4+ a CD8+ eliminují mikroby z buněk) o — Imunohematologie = protilátkový typ specifické imunitní odpovědi —Protilátky /imunoglobuliny — —produkty B-lymfocytů —přítomné na membráně B lymfocytů jako antigenní receptory (BCR) nebo rozpuštěné jako proteiny v krvi a v mukózních tekutinách —neutralizují a eliminují antigeny z krve a sliznic —působí pouze extracelulárně —rozeznávají jen určité typy antigenních molekul (sacharidy, složité chemické struktury s lipidy a proteiny) — — — Struktura imunoglobulinu — —4 polypeptidové řetězce protilátky H2L2 —obsahuje 2 identické těžké (H) a 2 identické lehké (L) řetězce —Tvoří tvar písmene Y, vzájemně spojené disulfidickými můstky —Dva fragmenty Fab + jeden fragment Fc, mezi nimi flexibilní otočná oblast —Variabilní část obsahuje oblast pro vazbu —antigenu —Konstatní část je neměnná, má oblast —pro jinou vazbu (komplement, fagocytoza) —Lehké řetězce: kappa, lambda —Těžké řetězce: rozlišení na izotypy —IgM,IgD,IgG,IgA,IgE — — — — — Struktura protilátky —Monomery IgG,IgD,IgE = dvě vazebná místa pro Ag —Dimer IgA = čtyři vazebná místa pro Ag —Pentamer IgM = deset míst pro Ag 0000007 0000005 0000004 Antigeny —Cizí substance navozující imunitní odpověď —Epitop (antigenní determinanta) = část Ag, na kterou se naváže protilátka —Jeden antigen může mít více různých epitopů —Obvykle proteiny, polysacharidy, lipidy, NK — —Antigeny v imunohematologii: —krevní skupiny erytrocytů —HLA (histokompatibilní, transplantační) antigeny — Komplement —soubor sérových a membránových glykoproteinů, které slouží jako humorální složka nespecifické imunity —nejdůležitějšími proteiny komplementu jsou sérové proteiny C1-C9, převážně proteolytické enzymy (kaskádová reakce) —hlavní funkce: —opsonizace bakterií při fagocytóze —chemotaxe fagocytů —zánětlivá reakce —lýza buněk (membránolytický komplex) —3 cesty aktivace komplementové kaskády: — klasická (kontakt s Ab) – uplatňuje se v imunohematologii — lektinová (vazba lektinu na bakteriální povrchy) — alternativní (s endotoxinem) Působení komplementu na erytrocyty —Masivní aktivace komplementu = intravaskulární typ hemolýzy (vzniku membránového komplexu MAC+ vazoaktivních peptidů): lýza erytrocytů — —Mírnější aktivace komplementu = extravaskulární hemolýza v RES: fagocytóza erytrocytů — —např. akutní HTR při AB0 neshodě, CAD……..i.v.lýza —např. pozdní HTR, HON, WAIHA …..fagocytóza — —Hemolýza = zkrácené přežívání erys na méně než 100-120 dní — Imunohematologická vyšetření —Princip: detekce imunních komplexů Ag+Ab —Hemaglutinační reakce = aglutinace (antigen = partikule ery, trc, leu) —Vzácně jiné metody ( ELISA, imunofluorescence, FCM, dnes častěji chipy, PCR...) —Rutinní použití pro stanovení antigenů, vyšetření protilátek, předtransfuzní testy —Různé aglutinační techniky - testy sklíčkové, zkumavkové, pevná fáze, sloupcová aglutinace v gelu —Testy při teplotě 20-23°C (PT), 4°C, 37°C dle cíle vyšetření — pasivní aglutinace Aglutinace přímá/ solný test —Solné prostředí = fyziologický roztok —IgM molekula překlene vzdálenost mezi 2 ery ØIgM = kompletní protilátky — — — — — —Použití: —Detekce erytrocytových Ag pomocí IgM Abs ØAB0, RhD, C, c, E, e, K, M, N aj. —Detekce antierytrocytových protilátek (IgM) Øanti-A, anti-B, chladové Abs Aglutinace nepřímá —Zásadní význam v imunohematologii —Hlavně pro detekci IgG protilátek, které nejsou schopné přímé aglutinace —Použití: —Detekce erytrocytových Ag pomocí IgG Abs ØDw/v (u dárců), Duffy, S, s aj. —Detekce antierytrocytových protilátek třídy IgG ØVšechny klinicky významné abs (kromě anti-A/-B) —Nepřímá aglutinace v situaci, kdy je nutné vizualizovat vzniklé imunní komplexy (u senzibilizující protilátky): —úprava erytrocytů pomocí enzymů —použití testu s AGH (antiglobulinum humanum) — — — — — — — Nepřímá aglutinace – enzymové testy —Bromelin, ficin, papain, trypsin —štěpí chemické vazby některých sloučenin na membráně erytrocytů (deriváty kyseliny neuraminové) – odkrývá antigenní místa a membránové antigeny se tak stávají dostupnější pro protilátky —snižují elektronegativní pole kolem erys a vzájemně je přibližují, umožňují tím navázání protilátky —v prostředí s enzymem získává protilátka vyšší schopnost aglutinovat erys (autoaglutinace) —nevýhoda: mohou se demaskovat nežádoucí antigeny (kryptantigeny) —obtížná standardizace ezymových testů (nespecické reakce) — —Jednofázový test (přidání enzymu do reakce) —dvoufázový test (enzymované erys) — — Nepřímá aglutinace – antiglobulinové testy (Coombsovy testy) —Používají protilátky proti lidským proteinům —(AGH sérum = Antiglobulinum humanum) —AGH detekuje protilátky i komplement – polysfecifické/monospecifické (IgG, IgM, IgA, C3d, IgG1..) —Pro vyšetření protilátek v séru i navázaných na erys, zkoušku kompatibility, vyšetření některých krevních skupin —Různé techniky provedení (zkumavkové, pevná fáze, sloupcová agl.), modifikace testů se zkrácením doby inkubace v LISS, užití PEG — — 18krvinky8 Aktuální doporučení: AGH test s použitím roztoku o nízké iontové síle (LISS), optimální metoda sloupcové aglutinace Nepřímá aglutinace – antiglobulinové testy (Coombsovy testy) —Dva typy AGH testů: — —Přímý AGH test (PAT) pro detekci protilátek na erys při in vivo senzibilizaci —Nepřímý AGH test (NAT) pro detekci protilátek v plazmě/séru po in vitro inkubaci plazmy/séra obsahujícího protilátku s erys — — NAT Krevní skupiny erytrocytů Krevní skupiny erytrocytů Krevní skupiny/skupinové systémy —Membránové/povrchové antigeny erytrocytů —Antigeny proteinové nebo sacharidové — (oligosacharidy-glykoproteiny-glykosfingolipidy- — glykolipidy) s biologickými funkcemi —Bialelické systémy (alela mateřská a otcovská) —Podléhají pravidlům mendelovské dědičnosti —V r. 2021: známo 43 skupinových systémů, celkem 378 antigenů —Syntetizované většinou na erytrocytech, ale také — naadsorbované z plazmy na buňky —Zastoupení nejen na erys, ale i na buňkách jiných tkání —Imunogeny/cizorodé = vznikají proti nim aloprotilátky — — — — Rozdělení krevních skupin podle struktury a funkce 1. 1.Podle struktury —Povrchové —Intramembránové —Transmembránové 2. 2.Podle funkce —Udržují integritu buňky —Transportéry —Aktivní enzymy —Receptory pro ligandy, adhezivní funkce — Dědičnost krevních skupin —Obvykle dvě alely pro určitý gen, může být i více alel v genu (genový polymorfizmus) —Alela dominantní – recesivní - kodominantní —Homozygotní jedinec: zdědil stejné alely v lokusu chromozomu (A/A , B/B, 0/0, K/K) —Heterozygotní jedinec: zdědil různé alely v lokusu (A/0, B/0, A/B, K/k) —Genotyp: genetická charakteristika jedince, určuje, jaké vzniknou antigeny —Fenotyp: manifestní znaky, vyšetřené antigeny krevních skupin (dominantní znaky), nemusí souhlasit s genotypem AB0 systém —nejdéle známý systém KS, nejvýznamnější z hlediska histokompatibility —dva antigeny: A, B - oligosacharidy —základ tvoří antigen H (KS 0 = prekurzorový řetězec pro A, B) — — —4 základní fenotypy: —A, B, AB, 0 — —6 genotypů: —A/A, A/0, —B/B, B/0, —A/B, —0/0 A,B antigeny —Gen AB0 (na 9.chr.) má 3 zákl. alely: kodominantní A a B a recesivní 0: —0 alela = neaktivní gen —Neprobíhá substituce oligosacharidů, exprimován pouze H antigen s fukózou —A alela = A transferáza —B alela = B transferáza —Připojením molekuly N-acetyl-galaktosaminu nebo galaktózy k H antigenu vznikne skupinově specifický (A nebo B) antigen — Matka/ otec 00 0 AA,A0 A BB,B0 B AB AB 00 0 00 A0,00 B0,00 A0,B0 AA,A0 A A0,00 AA,A0, 00 AB,A0, B0,00 AA,AB, A0,B0 BB,B0 B B0,00 AB,A0, B0,00 BB,B0, 00 AB,BB, A0,B0 AB AB A0,B0 AA,AB, A0,B0 AB,A0, BB,B0 AA,AB, BB AB0 protilátky —odlišují AB0 systém od všech ostatních skupin —anti-A a anti-B, u osob 0 také anti-A,B —pravidelné protilátky nacházející se v plazmě —přirozené protilátky při kolonizaci organismu mikroby - imunizace substancemi podobnými antigenům A,B během prvních měsíců života —vzácně jiný nález: novorozenci, slabé skupiny, nemoci —od 4. měsíce věku dostatečný titr Abs, stacionární během života, změny při imunizujících stavech v těhotenství, po transfuzích —AB0 protilátky IgM, ale i IgG nebo IgA C:\Users\8260\Desktop\Obrázek1.png Laboratorní vyšetření: —A a B antigeny na erytrocytech: —monoklonální dg. séra anti-A, anti-B (+ příp. anti-A,B) — —Pravidelné AB0 protilátky v séru: —detekce pomocí dg.erytrocytů A1,B (+ ery 0 nebo autoctl.) —u dětí do 4 měsíců se nevyšetřují — — —solný test pro přímou aglutinaci/ inkubace při laboratorní teplotě —Přímá aglutinace: metoda zkumavková, sloupcová aglutinace, sklíčková, mikrotitrační desky Laboratorní vyšetření KS — AB0 diskrepance —Jsou při vyšetření antigenů nebo protilátek —Diskrepance je nutné vyřešit před uzavřením výsledku —Opakovat vyšetření, provést vyšetření z nového vzorku, použít jiné reagencie spolu s kontrolami, zvolit jinou reakční teplotu, promýt erytrocyty, použít eluční techniky apod. dle typu problému —Podání AB0 inkompatibilního přípravku vede k těžké hemolytické potransfuzní reakci – fatální následky! —Pokud není stanovena skupina – univerzální režim: podávat 0 erytrocyty, AB plazmu Sérologické vyšetření ostatních krevních skupin —Princip sérologického vyšetření ostatních krevních skupin je stejný: Antigeny na vyšetřovaných erytrocytch detekujeme pomocí specifických diagnostických protilátek (dg. sér) v testu a technikou, které umožňují jejich průkaz. Je to naprosto dostačující pro běžné diagnostikování. —Kromě AB0 nejsou v jiné skupině pravidelné protilátky (proto dvojí potvrzení antigenu). —Genetické vyšetření umožní precizní diagnostikování skupinových antigenů, je zvláště přínosné u variantních antigenů, u transplantovaných a transfundovaných jedinců. Rh systém —Nejpolymorfnější systém – více než 50 známých antigenů —2 související geny RHD a RHCE (na 1.chromozomu) —RHD gen kóduje RhD protein ( D+) —negativní fenotyp D- : D gen chybí(delece – naše populace) či inaktivní —RHCE gen kóduje RhCcEe protein (kombinace antigenů Ce,ce,cE,CE) —každý gen 10 exonů,charakteristické uspořádání —mutace genu, rekombinace mezi genovými oblastmi vedou ke vzniku vzácných D alel —změny v genu se manifestují jako změny ve fenotypu, tj. změnou v expresi RhD antigenu - variantní D antigeny — Rh antigeny — —antigeny D,C,c,E,e (dále např. Cw, G, Hr…) —lokalizované na RhD a RhCE proteinu —výskyt dle typu populace (D+ cca u 85% Evropanů, 90% Afričanů) —vysoce imunogenní proteiny (složité molekuly) —několik desítek tisíc kopií na erytrocytu dle genotypu — — Rh antigeny —sérologické rozeznání pomocí dg. sér anti-D,-C,-c,-E,-e —existuje 8 haplotypů (Dce, DcE, DCe, DCE, dce, dCe, dcE, dCE) a 36 genotypů (= kombinace 2 haplotypů) —zygocii D/D a D/d nelze sérologicky odlišit — — — — — Antigeny D+C+c-E-e+ Fenotyp DCe/DCe R1R1 RhD+ CCee Genotyp DCe/DCe R1R1 DCe/dCe R1r´ D+C-c+E+e+ DcE/dce R2r RhD+ ccEe DcE/dce R2r DcE/Dce R2R0 Dce/dcE R0r´´ Variantní D antigeny: — —Weak D —kvantitativní změna antigenu — —Parciální (variantní) D —kvalitativní změna v mozaice antigenu — — Weak D, Dw — —Slabě exprimovaný antigen —Všechny D epitopy, žádná změna AMK v extramembranozní části RhD proteinu, mutace postihují intramembranozní a intracelulární část proteinu —Nebývá riziko imunizace D antigenem —Příjemci: RhD+ transfuze —Těhotné: anti-D profylaxe ne — —spousta typů – viz. — http://www.rhesusbase.info/ — Parciální (variantní) D, Dvar — —Chybí jedna nebo více částí/epitopů D antigenu — (změna v extramembranózní části RhD proteinu) —některé epitopy chybí, zbývající slabě vyjádřené —antigen je složený z jiných epitopů = nový tvar proteinu —Problém: vznik alo-anti-D, která reaguje se všemi RhD+ kromě vlastních ery —Příjemci: RhD- transfuze —Těhotné: anti-D profylaxe ano — —Spousta variant — (http://www.rhesusbase.info/) —Klinicky nejvýznamnější je — varianta D VI — Vyšetření RhD antigenu —rutinní vyšetření D antigenu v rámci krevní skupiny – přímá aglutinace —různé typy diagnostik anti-D: IgM, blend IgM/IgG, IgG —vyšetření 2 monoklonálními dg. séry s různými klony anti-D třídy IgM —diskrepance či zeslabení reakce – do dořešení uzavření výsledku jako Dw/v (TP dárce označen jako RhD poz., příjemce dostává RhD neg. ery TP) —validita testu - použití kontrolního séra „Rh ctl“(= diluentová kontrola bez obsahu Abs) k vyloučení falešně pozitivních výsledků —pro uzavření výsledku vyšetření RhD musí být Rh kontrola negativní Rh protilátky —Imunní, klinicky významné - vedou k destrukci erys —IgG —anti-D, -E, -c, -C, -e, -Cw —neaktivují komplement, vedou k extravaskulární hemolýze —IgG prochází placentou (aktivní transport) —klinické souvislosti: HON, HTR —anti-Rh tepelné autoprotilátky u AIHA —profylaktické použití anti-D jako prevence HON —průkaz v testech při 37°C —zvýšená reaktivita v enzymovém testu, efekt dávky (=Ab reaguje silněji s homozygotní krvinkou) — Kvíz – určování KS — Diagnostická séra Erys pac. anti-A ++++ anti-B - anti-D ++++ anti-D ++++ Rh ctl. - Typové erytrocyty Plazma pac. 0 - A1 - A2 - B ++++ Kvíz – určování KS — Diagnostická séra Erys pac. anti-A - anti-B ++++ anti-D - anti-D - Rh ctl. - Typové erytrocyty plazma pac. 0 - A1 ++++ A2 +++ B - Kvíz – určování KS — Diagnostická séra Erys pac. anti-A ++++ anti-B ++++ anti-D ++++ anti-D ++++ Rh ctl. - Typové erytrocyty plazma pac. 0 - A1 - A2 - B - Kvíz – určování KS — Diagnostická séra Erys pac. anti-A - anti-B - anti-D + anti-D ++ Rh ctl. - Typové erytrocyty plazma pac. 0 - A1 ++++ A2 +++ B ++++ Ostatní krevní skupiny Kell systém —glykoproteinové antigeny —silné imunogeny —Celkem 38 antigenů v systému, tvoří alelické páry: K/k, Kpa/Kpb, Jsa/Jsb —Nejvýznamnější antigeny: Kell (K), Cellano (k) —90% jedinců nemá K (Kell), 1% nemá antigen k (Cellano) — —Kell – protilátky: —imunní protilátky, IgG typ —klinicky významné —v etiologii HON (navíc suprese erytropoezy), HTR —dop. se nepodávat K+ ery dívkám a ženám ve fertilním věku —častá anti-K, vzácně anti-k — Kidd systém (Jk) —glykoproteinové antigeny Jka a Jkb (kodominantní) —Fenotypy: Jk(a+b-), Jk(a+b+) a Jk(a-b+) — —Kidd – protilátky: —imunní IgG typ, hemolyzující účinek při aktivaci komplementu (cca 50%) —méně časté, ale klinicky významné —nebezpečné, senzibilizované ery podléhají rychlé fagocytóze - přehlédnutelné (rychle odstraňovány z oběhu nemusí být detekovány při následujícím předtransf. vyš.) → rychlá sekundární imunologická odpověď, akutní potransfuzní reakce typu HTR —vzácně u HON — — — Systém Duffy (Fy) —glykoproteinové antigeny —alely Fya, Fyb - kodominantní —alela Fy u Afričanů (nefunkční alela bez Ag produktu) —fenotyp Fy(a-b-) protektivní pro malarii — —Duffy – protilátky: —imunní IgG typ —relativně častá anti-Fya , méně častá anti-Fyb —Klinický význam: —HON vzácně —někdy HTR (pozdní či akutní, obvykle s lehčím průběhem) — MNS systém —Glykoforiny transmembránové —GPA gen = MN antigeny (kodominantní) —GPB gen = Ss antigeny (kodominantní) — —MNS – protilátky: —většinou přirozené protilátky - chladové, IgM —-M,-N bez klinického významu —vzácně imunní IgG (anti-s,-S,-M) —-S,-s vzácně HON a HTR při aktivitě v NAT — Další systémy krevních skupin —I systém —Lewis —Lutheran —P systém —Chido/Rodgers (Ch/R) —Colton (Co) —Cromer (Cr) —Diego (Di) —Dombrock (Do) —Gerbich /Ge —… — Ostatní skupiny —Vysokofrekventní antigeny —Incidence více než 99% — —Vel, Lan, JMH, Sda, Ata —Obtížně identifikovatelné / referenční pracoviště —Téměř nelze najít kompatibilní erytrocyty pro imunizované —Nízkofrekventní antigeny —méně než 1% — —Chra, By, Bi, JONES, HJK,SARA —Vzácně imunizace transfuzemi, většina dárců antigen nemá HLA I. třídy na erytrocytech —Bg antigeny na zralých erytrocytech —Exprese jen u malé části populace —Protilátky proti nim vzácně vedou k HTR