Adobe Systems Mikroskopické techniky MUDr. RNDr. Michal Řiháček, Ph.D. Ústav laboratorní medicíny Fakultní nemocnice Brno Adobe Systems Historie mikroskopu 1590 – otec a syn Jansenovi (Holandsko) 1665 – R. Hooke, složený mikroskop, L. Pasteur (kvasinky) / R. Koch (TBC, cholera) 1670 – A. van Leeuwenhoek (Holandsko) 1847 – C. Zeiss, 1. výrobce _____________________ 1873 – něm. fyzik Abbe (teorie opt. přístrojů), 1931 – něm. fyzik E. Ruska, elektr. mikroskop Adobe Systems Mikroskopie Rozlišovací schopnost oka je 0,2 mm. Světelná mikroskopie rozlišuje 0,2 µm. Elektronová mikroskopie (1-0,2 nm). Adobe Systems Jaký typ pozorovacího zařízení použít pro…?: Germ with solid fill Germ outline What is folliculogenesis and what are its stages? Adobe Systems Jaký typ pozorovacího zařízení použít pro…?: Germ with solid fill Germ outline What is folliculogenesis and what are its stages? virus bakterie buňky sekundární oocyt (20-250 nm) (1-5 µm) (7-20 µm) (100-250 µm) Adobe Systems Optika Světlo = úzká oblast elektromagnetického záření viditelná okem (vlnění, 300 tis.km/s) Vlnová délka (definuje různé druhy elektromagnetického vlnění/záření) - 380-780 nm (bílé/polychromatické světlo) - barva: 380nm fialová, 450nm modrá, 500nm zelená, 550nm žlutá, 600nm oranž., od 650nm červená Vlny kratší - UV, RTG, γ Vlny delší - IR, rádiové vlny Adobe Systems Optika Dle speciální teorie relativity je intenzita světla úměrná amplitudě vlnové délky světla. Rozhraní 2 prostředí Odraz: úhel dopadu=úhlu odrazu, ve stejné rovině Lom: vychýlení ke kolmici dopadu (do prostředí hustšího od kolmice dopadu) (do prostředí řidšího) Index lomu N (opt. hustota vzduch 1,0 - voda 1,33 - sklo 1,46 – olej 1,5 – diamant 2,42 Adobe Systems Optika Disperze (rozklad) - závislost indexu lomu na vlnové délce. Bílé světlo se hranolem rozloží dle vln. délky na jednotlivé barvy (duha). Interference (skládání) Rozdělení a následné spojení 2 světelných toků. Dle synchronizace je fáze vlnění stejná n. posunutá a intenzita +vyšší nebo – nižší, ale „vlny se nerozcházejí“ Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 8 obrazek obrazek Adobe Systems page13image486569552 Optika Čočky tvar: vypuklý/konvexní, spojky - svazek sbíhavý vydutý/konkávní, rozptylky - sv. rozbíhavý opt. střed O s osou, hl.rovina (kolmá na osu) ohnisko F přední-obrazové, F' zadní-předmět. Hranoly broušené pod růz. úhly- změna chodu paprsků Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 9 Vady optických soustav Chromatická(barevná) – různý lom dle vln.délky světla, vada polohy a velikosti Sférická (kulová) – různý lom s křivostí č., body= překrývající se kruhy, nezřetelné Astigmatická – paprsky dopad. šikmo se neprotínají, tvoří 2 linie Vyklenutí – přímka z boku= oblouk, nelze dobře zaostřit ohnisko Adobe Systems Optické přístroje VY_32_INOVACE_59_Optické přístroje - ppt stáhnout Lupa Čočky Nejjednodušší optické zařízení 1 nebo více čoček (nejčastěji 1 spojka = nejjednodušší) Zvětšují zorný úhel Obraz: neskutečný zvětšený a přímý Zvětšení 5 – 12x (spec. až 30x) Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 10 Adobe Systems Mikroskop 2 optické části (několik čoček) na společné ose Objektiv – hlavní, tvoří obraz předmětu skutečný zvětšený a převrácený čelní čočka, pouzdro se závitem (revolver.měnič) Okulár – lupa zvětšuje obraz bez dalších detailů 5-25x vhodně koriguje optické vady čoček objektivu Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 11 Microscope with solid fill Objektiv Okulár Diagram Description automatically generated Adobe Systems Vlastnosti objektivů Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 12 40X-2500X LED Lab Binocular Compound Microscope w/ 3D Stage Ohnisková vzdálenost: 1,5(silné) - 20mm(slabé) Zvětšení = 250/ohnisk.vzdál. (max.150x) Světelnost – určuje otvorový úhel(2krajní paprsky) a Index lomu prostředí: sklíčko-vzduch n. lépe imerze (voda, olej) Numerická apertura = vztah mezi otvor. úhlem a lomivostí, čím je vyšší, tím lepší rozliš. schopnost (0,9 vzduch, 1,5 olej) Penetrační (hloubková) ostrost = zobrazení počtu rovinných vrstev preparátu, nutnost proostřování Adobe Systems Mikroskop – další části konstrukce Osvětlení – žárovka, kondenzor (čočky k soustředění paprsků), clony (irisová), ev. zrcátko Mechanické části stativ, tubus – spojuje objektiv (dole) a okulár, posun pomocí makro- a mikrometr. šroub, většinou binokulární (2 okuláry) s oční korekcí, stolek s otvorem a 2 pružinkami n. křížovým vodičem preparátu Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 13 40X-2500X LED Lab Binocular Compound Microscope w/ 3D Stage Adobe Systems Mikroskop – typy Běžný – metoda světlého pole v procházejícím světle (rovnoběžně s osou), ideální pro barevné preparáty Zástinový – metoda temného pole, paprsky šikmé, odrážejí se od preparátu (výrazně zvýší kontrast – vhodné pro čiré nativní preparáty) Stereomikr.(preparační) – 2 mikroskopy s osami v ostrém úhlu, každý z jiné strany, hranoly obracejí obraz na přímý, plastický Diskuzní n. srovnávací - pro 2 osoby Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 14 40X-2500X LED Lab Binocular Compound Microscope w/ 3D Stage Adobe Systems Další podkategorie mikroskopů Fázový kontrast – na fázové destičce v obrazové rovině objektivu se ohybem paprsku vyvolá změna fáze použití: zvýraznění detailů (obrysů) nativních preparátů Polarizační – kombinace s polarimetrem, přidány 2 polarizační nikoly (polarizátor u světel.zdroje, analyzátor za objektivem), otočný stolek s preparátem, 2-lomné struktury střídavě září a zhasínají – použití: mineralogie (dříve polarimetr – anal. AMK) Fluorescenční (luminiscenční) – látky po absorpci UV-záření vydávají barevné viditelné záření, přírodní n. po navázání fluorochromů – použití: imunocytochemie Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 15 40X-2500X LED Lab Binocular Compound Microscope w/ 3D Stage Adobe Systems Další podkategorie mikroskopů Ultrafialový – vyšší rozliš. schopnost UV světla, optika křemenná, záznam foto Infračervený – snadněji proniká silnými preparáty, záznam foto Elektronový – místo světla(fotonů) je tok elektronů ve vakuu, místo optických jsou čočky elektromagnetické, magnet. pole působí jako lom- dráha elektronů po spirále, zvětšení až 1milion TEM (transmisní)- elektrony přímo prostupují tenkým řezem (nm) a jsou detekovány (vnitřní struktury, atomy) REM, SEM (rastr, scan)- povrch vzorku rastrován svazkem elektronů, detekce uvolněných sekund. elektronů Klinika (ústav) Fakultní nemocnice Brno a Lékařské fakulty Masarykovy univerzity 16 40X-2500X LED Lab Binocular Compound Microscope w/ 3D Stage Adobe Systems Mikroskopické preparáty Nativní – fyziologické médium přirozené (sérum, moč, likvor) n. umělé (fyziolog.roztok) Vitální barvení – b. bazická (metyl.modř), kyselá (trypanová modř), ostatní (Sudan) Trvalé preparáty fixace: fyzikální (teplo), chemická (formol.páry, kys.octová, formalin, etanol) zpracování: uzavírací média, nátěry, řezy barvení (selektivní zvýraznění): dle Grama, May-Grünwalda a Giemsy, Pappenheima Adobe Systems Vyšetření likvoru Nativní – počet elementů Vitální barvení – počet jaderných elementů Trvalý preparát – dif. rozpočet jaderných buněk leukocytů obrázky k přednášce 014 IMG_0271 IMG_0277 IMG_0113 Adobe Systems Vyšetření kostní dřeně cytologicky + speciální cytochemická barvení (např. PAS, POX) u akutní leukemie A picture containing colorful Description automatically generated A picture containing meatball, dessert Description automatically generated A close up of water drops Description automatically generated with low confidence Adobe Systems Vyšetření kostní dřeně histologicky + imunohistochemie (protilátky proti receptorům značená fluorescenční značkou/barvou) > Adobe Systems Moderní buněčná optická analýza Průtoková cytometrie – rozdělení diferenciálního rozpočtu. Zlatý standard rutinní hematologie (vyšetření krevního obrazu). Digitální mikroskopie…