Chromatografické metody
RNDr. Alena Mikušková
FN Brno – Pracoviště dětské medicíny, OKB
amikuskova@fnbrno.cz
CHROMATOGRAFIE
 Separační (dělící) metoda a současně
 Analytická metoda - poskytuje kvalitativní a kvantitativní informaci o vzorku
 Využívá distribuce látek mezi dvě vzájemně nemísitelné fáze
• Stacionární (nepohyblivou), SF – pevná látka nebo na povrchu pevné látky
fixovaná kapalina
• Mobilní (pohyblivou), MF – kapalina nebo plyn
Fáze = homogenní část heterogenního systému oddělená od okolí fázovým rozhraním
 MF proudí přes nosič nebo kolonu obsahující SF
 Distribuce komponent směsi mezi obě fáze dle rozdílné afinity ke SF, MF
 jednotlivé složky směsi procházejí systémem různou rychlostí:
• látky s vyšší afinitou ke SF migrují pomaleji
• látky s nižší afinitou ke SF migrují rychleji
 Objevitel - ruský botanik Cvět
– přelom 19. a 20. století
– dělení rostlinných pigmentů
Klasifikace chromatografických metod
- Podle uspořádání systému
Chromatografie plošná (planární)
– SF (voda nebo polární
rozpouštědlo) zakotvená na
vláknech papíru (papírová
chromatografie)
– SF (silikagel, alumina, celulóza, aj.)
rozprostřená na inertní podložce
(chromatografie na tenké vrstvě,
TLC)
Chromatografie kolonová (sloupcová)
- SF (silikagel, polymer,…) tvoří náplň
kolony
- SF nanesená / chemicky navázaná na
nosné částice
- SF nanesená přímo na vnitřní povrch
kolony
- dle mobilní fáze - LC, GC
Klasifikace chromatografických metod
- Podle skupenství mobilní fáze
– plynová (gas chromatography, GC) – plynná MF
– kapalinová (liquid chromatography, LC) – kapalná MF
- Podle způsobu vymývání frakcí vzorku z kolony
– frontální
– vytěsňovací
– eluční
- Podle složení mobilní fáze
– izokratické dělení - mobilní fáze má po celou dobu dělení konstantní složení
– dělení s proměnlivým složením mobilní fáze
• stupňovitá eluce
• gradientová eluce
- Chromatografie podle účelu
– Preparativní - pro přípravu většího množství čistých látek
– Analytická - pro určení identity a koncentrace látek ve směsi
Klasifikace chromatografických metod
Podle separačního mechanismu:
 Iontová výměna - rozdílná afinita nabitých částic k opačně nabitým
funkčním skupinám SF
 Rozdělování – interakce kapalina – kapalina
 Adsorpce – interakce kapalina – pevná látka
 Gelová permeační chromatografie – omezení transportu látek pórovitým
materiálem
 Afinitní chromatografie – interakce ligand – vázaná látka
 Kombinace metod
Klasifikace chromatografických metod
Iontoměničová chromatografie (ionexová, ion-exchange, IEC)
 výměna iontů elektrostaticky vázaných na nabitém povrchu SF a iontů v roztoku
 SF - iontoměnič (ionex): částice gelu s navázanými nabitými funkčními skupinami:
• Katexy (umožňují výměnu kationtů)
• silně kyselé sulfonové skupiny –SO3
-H+
• slabě kyselé karboxy-, karboxymethyl-, sulfomethyl-, fosfo-, apod. skupiny
Anexy (umožňující výměnu aniontů)
• silně bazické triethylaminoethylové skupiny
• slabě bazické aminoethyl-, diethylaminoethyl-, guanidoethyl- apod. skupiny
 na těchto skupinách vázán opačně nabitý ion (zachování elektroneutrality)
 tento je na začátku analýzy vyměněn za ionty analytů ze vzorku
 složky dělené směsi pak z kolony eluovány
 postupnou změnou pH
 a/nebo změnou iontové síly MF
 IEC umožňuje dělit ionty
• nízkomolekulární - aminokyseliny, nukleotidy
• vysokomolekulární - peptidy, proteiny,
oligonukleotidy,
nukleové kyseliny
Klasifikace - Podle separačního mechanismu
Rozdělovací chromatografie
Distribuce látek mezi dvě nemísitelné tekutiny
– rozdíly v rozpustnosti složek vzorku v MF a SF (LC)
– rozdíly hodnot rozpustnosti složek vzorku ve SF (GC)
SF - vždy kapalina:
– naadsorbovaná / chemicky navázaná na nosiči
- (např. na vláknech papíru u papírové chromatografie, na nosných částicích u HPLC)
– nanesena na vnitřním povrchu kapilární kolony (GLC)
MF – kapalina nebo plyn
– plynová (gas-liquid, GLC, zjednodušeně GC)
– kapalinová (liquid-liquid, LLC, zjednodušeně LC) ve dvou provedeních:
• LLC s normální fází - SF polární, MF méně polární
• LLC s obrácenou fází - SF nepolární, MF polární (častější provedení)
- vhodnější pro separaci méně polárních látek
Rozdělovací koeficient (K) - rozhoduje o pohyblivosti jednotlivých složek směsi
K = c org / c vod
c org ... koncentrace rozpuštěné látky v organické fázi
c vod ... koncentrace rozpuštěné látky ve vodné fázi
Klasifikace chromatografických metod
Adsorpční chromatografie
Dělení založeno na rozdílech v adsorpci a desorpci látek směsi na pevný povrch
sorbentu (elektrostatické síly, vodíkové můstky, disperzní síly)
Adsorpci popisuje tzv. Langmuirova adsorpční izoterma (závislost množství analytu
ve stacionární fázi na koncentraci v mobilní fázi)
CS = w . z . CM / (1 + w . CM)
 w … adsorpční koeficient pro daný analyt
 z … počet volných interakčních míst na povrchu
 CS, CM… koncentrace analytu v obou fázích
 nízké koncentrace analytu v MF - lineární závislost CS na CM
 vysoké koncentrace CM - vysycení interakčních míst sorbentu, závislost se zakřivuje
Klasifikace chromatografických metod
Gelová permeační chromatografie
 Umožňuje dělit molekuly podle jejich velikosti a tvaru:
 SF - gelové částice kulovitého tvaru (na bázi polysacharidů nebo polyakrylamidu)
s póry definovaných rozměrů
 Malé molekuly - difusním pohybem vnikají do vnitřních prostor gelových částic - na
koloně zadržovány
 Velké molekuly - nedostanou se do pórů, jsou unášeny proudem MF a vytékají
z kolony dříve
Klasifikace chromatografických metod
Afinitní chromatografie
využívá specifické interakce molekul:
 interakce biologické povahy
• enzym - substrát
• enzym - inhibitor
• antigen - protilátka
• receptor - hormon apod.
 biologickou interakci napodobující
• bílkovina - triazinové barvivo
• bílkovina - kovové ionty apod.
Jeden z partnerů (tzv. ligand) - pevně navázán na nosič (náplň kolony)
V dělené směsi (v MF) - přítomna řada molekul, z nich jen některé mají afinitu k
ligandu → naváží se, ostatní složky směsi se z kolony vymyjí
změna složení mobilní fáze tak, aby se oslabila interakce ligand – navázaná molekula
→ uvolnění z kolony
separace, izolace, čistění složek vzorku
Přehled chromatografických technik
Chromatografie
■ planární
 papírová rozdělovací
 tenkovrstvá TLC
• tenkovrstvá rozdělovací (SF kapalina)
• tenkovrstvá adsorpční (SF pevná látka)
■ kolonová
 plynová GC
• plynová rozdělovací GLC (SF kapalina)
• plynová adsorpční GSC (SF pevná látka)
 kapalinová LC
• kapalinová rozdělovací LLC (SF kapalina)
• kapalinová adsorpční LSC (SF pevná látka)
 gelová permeační GPC
 iontově výměnná IEC
 afinitní (a další)
Planární
chromatografie
 Nanesení chromatogramu - vzorky na startovní pozici blízko okraje plošného nosiče
(papíru, tenké vrstvy) ve formě malých kapek nebo tenkých čar
 Vyvíjení chromatogramu – v chromatografické vaně:
 spodní konec nosiče ponořen do MF pod úrovní startovací linie
 MF v důsledku kapilárních sil migruje přes SF, unáší s sebou složky směsi v závislosti
na jejich afinitě ke SF
• papírová chromatografie umožňuje i sestupné uspořádání - dle směru pohybu MF
 Vizualizace skvrn - usušený chromatogram lze vizualizovat
• barvotvorným činidlem
• osvícením UV světlem
• fluorescenčně
 Charakteristikou látky je retenční faktor Rf
 hodnota Rf - pro dané uspořádání experimentu stálá
Rf = A / B
A…vzdálenost start – střed skvrny
B…vzdálenost start – čelo rozpouštědla
Planární chromatografie
 Dvourozměrná TLC
• Vyvíjení chromatogramu první
mobilní fází
• otočení usušené destičky o 90 st.
• vyvíjení druhou mobilní fází
• dokonalejší separace
 HPTLC (high perfomance thin layer
chromatography) - tenká vrstva sestává z částic
o malém průměru (4,5 μm)
 Planární techniky - metody kvalitativní nebo
semikvantitativní s vizuálním hodnocením srovnáním
se skvrnami standardů
chromatografovaných na témže nosiči
Kolonová chromatografie
Chromatogram
 grafický záznam odezvy detektoru jako funkce
času, případně objemu:
• Při postupu vzorku kolonou se jednotlivé
složky vzorku separují, tj. dospějí do
detektoru v různých retenčních časech
• eluované analyty graficky znázorněny jako
série vrcholů (píků)
 data reprezentovaná chromatogramem slouží
k identifikaci a kvantifikaci analytů:
- retenční čas tR – kvalitativní charakteristika analytu
- plocha chromatografického vrcholu – kvantitativní
charakteristika
- koncentrace analytu vypočítána na základě porovnání
plochy píku analytu s plochou píku standardu
- plochu píku lze vypočítat jako: výška x poloviční šířka
(h x w1/2)
Kolonová chromatografie
Základní pojmy – popis chromatografického píku
• tRj (min)…retenční čas j-tého analytu (celkový čas, který příslušný analyt stráví v
koloně)
• tM (min)…mrtvý čas kolony (retenční čas analytu, který není v koloně zadržován, tj.
pohybuje se stejnou rychlostí jako MF)
• W1/2j…šířka píku j-tého analytu v polovině výšky
• Wj…šířka píku j-tého analytu u základny
• t’R,j (min)…redukovaný retenční čas j-tého analytu (čas, který příslušný analyt stráví
ve stacionární fázi)
t’R,j = tR,j – tM
Obdobně:
- retenční objem VRj
- mrtvý objem VM
- redukovaný retenční objem V‘Rj
V’R,i = VR,i – VM
Kolonová chromatografie
Termodynamika a kinetika separace na koloně
 Postup vzorku kolonou → jednotlivé složky vzorku (analyty) se separují, tj.
dospějí do detektoru v různých retenčních časech
– tento děj popisují termodynamické pojmy
 distribuční (rozdělovací) konstanta KD
 kapacitní faktor (retenční faktor, kapacitní poměr) k
 Při postupu vzorku kolonou se zóny analytů postupně rozšiřují vlivem difůze
- tento děj popisují kinetické pojmy
 počet teoretických pater dané kolony n
 výškový ekvivalent teoretického patra H
 Termodynamika a kinetika spolu úzce souvisí
– obě určují, jak dokonale budou zóny sousedních analytů odděleny
Kolonová chromatografie
Termodynamika separace na koloně
 Distribuční (rozdělovací) konstanta KDi
• (ci)s, (ci)m...koncentrace i-tého analytu ve SF a MF ( c = n / V)
• (ni)s, (ni)m…látkové množství i-tého analytu ve SF a MF
• Vs (ml)…objem SF kolony
• Vm (ml)…objem MF v koloně
 Kapacitní faktor (retenční faktor, kapacitní poměr) ki
 lze zjistit přímo z chromatogramu
 
 
 
  s
m
mi
si
mi
si
iD,
V
V
n
n
c
c
K 
 
  m
s
iD,
mi
si
i
V
V
K
n
n
k 
M
iR,
M
MiR,
i
t
t´
t
t-t
k 
M
R,i
M
MR,i
i
V
V´
V
V-V
k 
Kolonová chromatografie
Kinetika separace na koloně
 Teoretické patro chromatografické kolony
– pomyslná část kolony, ve které dojde k jednomu ustavení rovnováhy mezi SF a MF
– Délka této části kolony = tzv. výškový ekvivalent teoretického patra
– vyšší počet teoretických pater → vyšší účinnost kolony
 počet teoretických pater dané kolony – n
 wj…šířka píku analytu při základně
 výškový ekvivalent teoretického patra – H (mm)
 L…délka kolony (mm)
2
j
jR,
w
t
16n








 
2
jR,
j
t
w
16
L
n
L
H








 
Kolonová chromatografie
Termodynamika a kinetika separace na koloně
 Výškový ekvivalent teoretického patra (H) závisí na lineární rychlosti mobilní fáze (u)
 Závislost vyjadřuje Van Deemterova rovnice
H = A + B / u + C . u
 A…vířivá difůze,
 B…podélná molekulární difůze,
 C…odpor proti přenosu hmoty v SF a MF
• Vířivá difůze (1) – úměrná velikosti částic SF (hlavně u HPLC) různé
molekuly urazí při pohybu kolonou různé vzdálenosti
• Podélná molekulární difůze (2) - molekuly putují z místa o vyšší
koncentraci do místa s nižší koncentrací
• Odpor proti přenosu hmoty ve SF (3) - různé molekuly
difundují různě hluboko do SF (závisí na typu SF), hlavně u GC
• Odpor proti přenosu hmoty v MF (4)
• minimum Deemterovy křivky odpovídá optimální průtokové rychlosti, při které
– daná kolona vykazuje největší účinnost (má největší počet pater)
– minimálně rozšiřuje zóny analytů
Kolonová chromatografie
Termodynamika a kinetika separace na koloně
Rozlišení R - míra chromatografické separace
– pro dobré rozdělení dvou sousedních analytů) je nutné, aby analyty měly
- dostatečně rozdílné retenční časy (správná volba SF, MF - termodynamika)
- dostatečně úzké zóny (délka kolony, velikost částic SF, u - kinetika)
Ri,j…rozlišení i-tého a j-tého analytu
Zlepšení špatného rozlišení látek A, B (a)
• změnou termodynamických faktorů (b),
• kinetických faktorů (c)
• zkrácení analýzy změnou průtokové rychlosti MF
 
ji
R
ji
jR,iR,
ji,
ww
Δt2
ww
tt2
R






Plynová chromatografie, GC
 Mobilní fáze - nosný plyn (nejčastěji inertní plyn - dusík, helium, argon)
 Separace u GC je založena
 na rozdílech tlaku par analytů
 interakcích se stacionární fází
- těkavější analyty se pohybují kolonou rychleji než analyty méně těkavé a navíc analyty
interagující se stacionární fází procházejí kolonou pomaleji než analyty se slabší interakcí
 GSC - separace na základě adsorpce analytů na pevný povrch náplně kolony
 GLC - separace na základě rozdělení mezi plynnou MF a kapalnou SF (netěkavá
kapalina zakotvená na částicích náplně nebo přímo na vnitřním povrchu
kapilární kolony)
 Plynový chromatograf
• zdroj mobilní fáze a zařízení pro kontrolu průtoku
nosného plynu systémem
• dávkovač pro nanesení analytu na kolonu
• chromatografická kolona pro separaci analytů
• termostat (pec) pro regulaci teploty kolony
• on-line detektor pro detekci separovaných analytů
vycházejících z kolony
• PC pro kontrolu systému a vyhodnocení dat
Plynový chromatograf
Zdroj nosného plynu a systém kontroly průtoku
 nosný plyn - např. He, Ar, N2, H2 (dle typu kolony a
detektoru)
 nosný plyn musí být velmi čistý a suchý
• trubice s molekulovým sítem odstraňují H2O, uhlovodíky, O2
 nutná řízená rychlost průtoku nosného plynu (pro získání
reprodukovatelných retenčních časů)
• regulace průtoku plynu z tlakové nádoby programovatelné
elektronické regulační systémy
– náplňové kolony: průtok 10 - 60 ml/min
– kapilární kolony: 1 - 2 ml/min (stabilní !)
Dávkovač
 vnáší alikvot vzorku (µl) do kolony
 vzorky v org. rozpouštědle dávkovány injekční jehlou přes septum do vyhřívaného
prostoru - ihned převedeny do plynné fáze a vneseny do kolony nosným plynem
 split - splitless technika dávkování vzorku na kolonu:
– split mód - do kolony vstupuje pouze malá část zplyněného vzorku - pro kapilární kolony
– splitless mód - do kolony vstupuje většina vzorku
Plynová chromatografie, GC - kolony
Náplňové kolony - starší typ, již málo používané
– trubice (vnitřní průměr řádově mm, délka 1 m a více, sklo
nebo nerez ocel) naplněné nosnými částicemi
– částice náplně jsou samy o sobě stacionární fází (GSC –
sorbenty: modifikovaný silikagel, aktivní uhlí, alumina,
molekulové síto, porapaky,…)
– částice jsou stacionární fází potaženy (GLC)
 užší kolony
• vyšší účinnost
• menší kapacita pro vzorek
 delší kolony
• vyšší účinnost
• nutné zvýšené tlaky nosného plynu
Kapilární kolony - WCOT (wall-coated open tubular column)
– kapiláry z křemenného skla (vnitřní průměr 0,1 - 0,5 mm,
délka 10 - 150 m)
– na povrchu potaženy polyimidem (pevnost a pružnost)
– vnitřní povrch potažen tenkým filmem SF
– velmi účinné
– malá kapacita pro vzorek
Plynová chromatografie, GC - kolony
Stacionární fáze pro GLC
 netěkavé chemicky inertní kapaliny: methylsilikonové polymery, substituované
silikonové polymery, silikonové polyestery, polyethylenglykoly apod.
 naneseny nebo chemicky navázány přímo na vnitřním povrchu kapilární kolony
 Dostupné i GC mikrokolony na bázi silikonového čipu
Plynový chromatograf - detektory
 Univerzální detektory - detegují většinu analytů
 Selektivní detektory
– kombinace více detektorů
Plamenově ionizační detektor (flame ionization detector, FID)
– univerzální detektor pro GC
– efluent z kolony smísen s H2 a vzduchem, eluované analyty jsou
spáleny v plameni
– v plameni dochází k ionizaci a vzniklé ionty zvyšují vodivost plamene
NPD (nitrogen – phosphorus detector) modifikace FID
– nad plamen umístěna vyhřívaná kulička soli alkalického kovu (Rb, Cs)
– přítomnost iontů alkalického kovu v plameni zvyšuje signál pro analyty
obsahující dusík a fosfor
Fotoionizační detektor (photoionization detector, PID)
– ionizace intenzivním UV zářením
– selektivní pro UV absorbující látky
Termovodivostní detektor
(thermal conductivity, TCD)
– v přítomnosti analytu v nosném plynu
se zvyšuje tepelná vodivost plynu
– univerzální, jednoduchý, horší citlivost
Detektor elektronového záchytu (electron capture, ECD)
– snížení ionizace nosného plynu v důsledku vychytávání
elektronů z ionizujícího β-zářiče elekronegativními
skupinami
Hmotnostní detektor (mass spectrometry detector, MSD)
Plynová chromatografie
Příprava vzorků pro GC analýzu:
 extrakce sledovaných analytů ze vzorku
biologického materiálu do organického
rozpouštědla
+ odpaření rozpouštědla z extraktu
 chemická derivatizace - zvýšení těkavosti a
termostability látek pro GC analýzu (klinicky
významné látky jsou zpravidla netěkavé)
– silylace – substituce atomu vodíku
funkčních skupin látek silyl-skupinou
(R3Si–)
– oximace – tvorba oximů kondenzací
aldehydů nebo ketonů s hydroxylaminem
NH2OH
– acylace, esterifikace
Kapalinová chromatografie - LC
 Separace založena na rozdělení látek mezi kapalnou mobilní fázi a fázi stacionární
 High perfomance liquid chromatography (HPLC) - jako nosič použity částice malého
průměru (5 µm),
 HPLC je v klinické laboratoři nejrozšířenější forma LC (všechny principy dělení)
Kapalinový chromatograf
• kolona pro separaci analytů
• zásobníky rozpouštědel (mobilní fáze)
• čerpadla pro zajištění průtoku mobilní fáze systémem
• dávkovač pro nanesení vzorku na kolonu
• on-line detektor pro detekci separovaných analytů
• PC pro kontrolu systému, sběr a vyhodnocení dat
Kapalinový chromatograf
Zásobníky s mobilními fázemi
 v nejjednodušší formě skleněné lahve s přívodními hadičkami k čerpadlům
 MF připraveny z čistých rozpouštědel určených pro chromatografii (HPLC grade)
 MF přefiltrovány přes membránový filtr pro odstranění případných pevných částic
 MF zbaveny rozpuštěných plynů – sonikace, vakuové degassery (odplyňovače)
Čerpadla
• čerpadla zajišťují reprodukovatelný, konstantní a bezpulzní průtok MF systémem
• v systému je nutné vyvinout vysoké tlaky (až 250 bar)
(1 bar = 105 Pa = 1,02 atm = 14,5 psi)
 bezpulzní tzv. lineární dávkovač - pro malé průtoky MF
- pracuje na principu injekční stříkačky
 pulzní pístová dvojúčinná (reciproká) čerpadla
- činnost je fázově posunutá pro minimalizaci pulzů
– Vyhlazení pulzů
• tlumič pulzů na principu svinuté odporové kapiláry
• nebo redukce pulzů změnou rychlosti pohybu pístů
 izokratický mód práce čerpadla
- složení MF zůstává konstantní během celé analýzy
 gradientový mód
- změna složení MF s časem - až čtyři složky MF programovatelně směšovány gradientovým
ventilem
Kapalinový chromatograf
Dávkovací zařízení
– šesticestný ventil s vyměnitelnou smyčkou
• objem od desítek nanolitrů po mililitry
• plnící pozice (poloha A) - vzorek se nasaje ze vzorkové nádobky (tzv.
vialky) dávkovací injekční stříkačkou do smyčky
• otočením ventilu do polohy B je obsah smyčky vnesen do proudu mobilní
fáze
• dávkovací ventil je přesný, programovatelný
 Další možnosti
– dávkovače s děličem (obdoba
splitovacího zařízení v GC)
– dávkovače s možností smísení
vzorku s derivatizačním činidlem
před nadávkováním na kolonu
(předkolonová derivatizace)
HPLC kolona
Náplňové kolony
 běžné kolony - vnitřní průměr 0,1 - 5 mm, délka 50 - 250 mm
 tzv. nanobore kolony - vnitřní průměr 25 - 100 µm
 open-tubular kolony - průměr pod 25 µm
 částice náplně různé velikosti - průměr 1,8 - 10 µm
Obecně platí:
– kolony s malým vnitřním průměrem a malým vnitřním objemem - vyšší účinnost, nižší limit
detekce, malé objemy MF
– čím menší částice náplně, tím větší je účinnost kolony (ale tím větší je odpor vrstvy náplně
proti pohybu MF)
Typy částicových náplní LC kolon
– náplně s navázanou fází - SF chemicky navázána na povrch částic silikagelu (C18, C8,…)
– polymerní náplně - SF na povrchu polymerních částic – vysoká pH odolnost
– chirální náplně - pro separaci enantiomerů
– restricted-access náplně - analýza biologických směsí s vysokým obsahem proteinů
Monolitické kolony
– vysoká účinnost a nízké zpětné tlaky
– kolona zcela vyplněna pórovitým polymerem
Kapilární kolony pro LC (0,1 - 1 mm vnitřní průměr, 10 - 50 cm délky)
• dostupné jsou i analytické HPLC čipy
Předkolona
– ochrana kolony před ireverzibilní adsorpcí proteinů ze vzorku
– naplněna stejnou nebo podobnou SF jako analytická kolona
Kapalinový chromatograf - detektory
 Detektor (s výjimkou MSD) obsahuje průtokovou celu - zde detegovány separované analyty
 generovaný elektronický signál zaznamenán ve formě chromatogramu
 Fotometry a spektrofotometry - měření absorbance UV a VIS záření
– Detektory s fixní vlnovou délkou
– Detektory s variabilní vlnovou délkou
– Detektory diodového pole (PDA) - schopné měřit v celé oblasti λ
- průtokovou kyvetou prochází polychromatické světlo
- prošlé světlo je za kyvetou rozděleno difrakční mřížkou
- světlo dopadá na diodové pole
 Fluorometry - pro detekci fluorescenčních látek
- často nutná před- nebo postkolonová derivatizace analytů
 Elektrochemické detektory
– amperometrické el.-chem. detektory
• oxidace nebo redukce elektroaktivního analytu v průtokové cele na povrchu elektrody
s konstantním potenciálem → zaznamenám vzniklý elektrický proud
• př. analýza katecholaminů v moči
– coulometrické detektory
- oxidace nebo redukce analytu → měření elektrického náboje
- př. stanovení metanefrinů, vanilmandlové kyseliny, homovanilové kyseliny nebo 5hydroxy-indoloctové
kyseliny v moči
 Refraktometrický detektor měří změny indexu lomu eluátu v závislosti na koncentraci analytu
 Hmotnostní detektor
HPLC, UPLC
Výrobci HPLC systémů
• např. Waters, Agilent Technologies, Thermo, PerkinElmer, Shimadzu, Varian,
Amersham Pharmacia, Dionex, Jasco, Gilson, Hitachi, BioRad a další…
UPLC, UHPLC
 Ultra high-perfomance liquid chromatography
 vyšší separační účinnost než klasická HPLC
 UHPLC využívá chromatografické kolony s
částicemi < 2µm
 přístroje schopné pracovat s ultravysokými tlaky
(100 MPa)
 práce s širokým rozsahem průtoků
 významné zkrácení doby analýzy
 Výrobci UPLC - např. firma Waters, Thermo,
Perkin-Elmer, Dionex, BioRad a další.
 UPLC Waters Acquity (s MS detektorem)
Příprava vzorků pro HPLC analýzu
Deproteinace, čištění vzorku a zakoncentrování analytů
Srážení proteinů – org. rozpouštědlo, kyselina
Ultrafiltrační techniky - úprava roztoků pomocí polopropustných
membrán
– hustota membrány limituje velikost separovaných molekul
– technika je vhodná pro deproteinaci vzorků
Extrakční techniky
 Kapalinová extrakce analytů do organického rozpouštědla
– L-L extrakce při vhodném pH
– organický extrakt se odpařuje v proudu inertního plynu (N2)
– odparek se rozpustí v nezbytném objemu mobilní fáze
Extrakce pevnou látkou (solid phase extraction, SPE)
 využití kolonek naplněných médiem dle charakteru látky -
sorbent, iontoměnič, gel atd.
 vzorek v roztoku se kolonkou prolévá pod tlakem
 nezachycené složky (proteiny,…) se vymyjí
 zachycené složky se uvolní vhodným rozpouštědlem
 SPE je automatizovatelná
Pozn.: Možnost přímé HPLC analýzy vzorků s obsahem proteinů
• Restrict – access material
Pozn.: Možnost analýzy látek iontové povahy pomocí RPC
Iontově párová chromatografie (IPC)
• modifikace RPC (LLC s obrácenou fází, revers-phase chromatography)
– zlepšuje separaci sloučenin iontové povahy
• přídavek do MF: iontově párující činidlo mající hydrofobní část (alifatický řetězec) a
hydrofilní část
– např. N-alkyl kvartérní amoniové soli pro separaci látek aniontového typu
soli alkylsulfonových kyselin pro separaci látek kationtového typu
+ vhodné pH MF, aby bylo dosaženo úplné ionizace dělených analytů
• dělená látka iontové povahy a opačně nabitý ion vytvoří iontový asociát
– asociáty jsou neutrální, vykazují zvýšenou retenci na nepolární SF
Derivatizace analytů
• zlepšení separace na koloně
• umožnění nebo usnadnění detekce analytů
– předkolonová derivatizace
• např. derivatizace aminokyselin a jiných primárních aminů
• vznik fluorescenčních sloučenin → detekce fluorometrem
• Vznik UV absorbující látky → detekce v UV
– postkolonová derivatizace
• např. u analyzátorů aminokyselin
• eluované aminokyseliny za kolonou derivatizovány ninhydrinem
fotometrická detekce
Chromatografie - kvantitativní analýza
Kalibrační techniky:
Externí kalibrace (kalibrace s vnějším standardem):
– provedení analýz referenčních vzorků se známým
obsahem analytu
– sestavení kalibrační křivky - velikost ploch píků analytu
v závislosti na jeho koncentraci
– použití kalibrační závislosti pro vyhodnocení koncentrací
analytu v reálných vzorcích
Interní kalibrace (kalibrace s vnitřním standardem):
– provedení analýzy referenčních vzorků se známým obsahem
analytů s přídavkem konstantního množství vnitřního standardu
vnitřní (interní) standard – sloučenina s podobnými vlastnostmi
jako stanovované analyty, ale nevyskytující se v reálných
vzorcích
– do kalibrační křivky se vynáší poměr plochy píku analytu a plochy
píku vnitřního standardu v závislosti na koncentraci analytu
– do reálných vzorků se přidává interní standard ve stejném množství
jako do referenčních roztoků
– koncentrace analytu se vyhodnocuje na základě poměru plochy
(výšky) odpovídajícího píku a píku vnitřního standardu
Kalibrace
0
40000
80000
0 10 20 30 40 50
koncentrace (nmol/l)
plochapíku
Kalibrace
0
1
2
0 10 20 30 40 50
koncentrace umol/l
plochaanalytu/plochaIST
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
Tenkovrstvá chromatografie (TLC, HPTLC)
 kvalitativní, příp. semikvantitativní analýza
 flexibilní levná matoda
 umožňuje souběžně analyzovat více vzorků
 nevyžaduje přístroje a náročnou přípravu
 velmi časté využití v toxikologii průkaz THC
– cílené průkazy nejrůznějších nox (jedů, škodlivin)
– orientační screening léků a drog
– pozitivní výsledky z toxikologického screeningu musí být konfirmovány pomocí dalších
chromatografických metod (př. HPLC, často ve spojení s hmotnostní spektrometrií)
HPTLC – sacharidy HPTLC – lipidy dvojrozměrná TLC – složené lipidy
Praktické aplikace chromatografických
technik v klinické biochemii - příklady
Papírová chromatografie
 jednoduchá, již málo používaná technika př. screening aminokyselin v moči
Ionexová chromatografie (IEC)
 Analýza aminokyselin
– vzorek - deproteinovaná plazma resp. sérum, moč, CSF - směs volných aminokyselin (AMK)
– AMK vneseny na kolonu s katexem ve formě kationtů (při nízkém pH)
– AMK postupně eluovány z kolony pufry o zvyšující se eluční síle (rostoucí pH a iontová síla)
– postkolonová derivatizace ninhydrinem
– kvalitativní vyhodnocení chromatogramu - na základě retenčních časů
– kvantitativní vyhodnocení pomocí vnitřního standardu (syntetická AMK norleucinu)
Analyzátor AMK (Perkin – Elmer)
 Další využití IEC
• nukleotidy, peptidy, proteiny, oligonukleotidy, nukleové kyseliny
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
HPLC rozdělovací
 z chromatografických metod nachází nejširší uplatnění v klinické biochemii
 většina aplikací využívá HPLC s reverzní fází
 lze ji aplikovat na široké spektrum analytů v závislosti na způsobu detekce
– sacharidy - karboxylové kys. - aminokyseliny
– lipidy - steroidy - katecholaminy
– léky - drogy - homocystein
– pteriny - CDT - glykovaný hemoglobin atd.
 HPLC se uplatňuje jako standardní metoda v toxikologii, hlavně v kombinaci
s hmotnostní spektrometrií
Analýza
7-dehydrocholesterolu
(prekursor cholesterolu
– endogenní syntéza):
- záznam z PDA
- chromatogram při λmax
Karboxylové kyseliny dynamika
přeměny kys.
benzoové na kys.
hippurovou (detoxikační
reakce)
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
Záznam HPLC analýzy katecholaminů v moči z HPLC Agilent série 1200,
elektrochemický detektor Coulochem
Katecholaminy – adrenalin, noradrenalin, dopamin
Metanefriny – metanefrin, normetanefrin (metabolity katecholaminů)
Kys. vanilmandlová (metabolit katecholaminů)
- markery feocytochromu (nádor sympatoadrenálního systému, nejčastěji dřeně nadledvin)
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
Analýza CDT (karbohydrát-deficientní transferin)
 detekce nadměrného užití alkoholu
 monitorování abstinence v průběhu léčby
 Transferin - glykoprotein vázající železo
– obsahuje 2 polysacharidové řetězce
– variabilní množství kyseliny sialové
– podle počtu skupin kyseliny sialové - 6 izoforem
a-, mono-, di-, tri-, tetra- a penta-sialotransferin
– disialotransferin - cílová sloučenina pro stanovování CDT HPLC analýzou
- pozitivní pacient - negativní pacient
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
HPLC analýza glykovaného hemoglobinu
 HbA1c - stabilní adukt glukózy s N-terminální aminoskupinou valinu β–řetězce
hemoglobinu
 Diferenciální diagnostika diabetu
 Určení kompenzace a stability glukózového metabolismu
 Monitorování terapie
 Izolace a hemolýza erytrocytů
- EDTA krev
- izolace erytrocytů centrifugací, promytí fyziologickým roztokem
- lyzace erytrocytů
- HPLC analýza (ionex.
kolona)
HPLC Analyzátor HbA1c
Tosoh
Praktické aplikace chromatografických
technik v klinické biochemii - příklady
Analýza těkavých látek v kapalných nebo pevných vzorcích:
GC v uspořádání head-space
• „head space“ – dávkování z prostoru nad vzorkem (plynná fáze po
ustavení rovnováhy)
např. - analýza zbytků rozpouštědel ve farmaceutických výrobcích
- stanovení alkoholu v krvi, atd.
Praktické aplikace chromatografických technik
v klinické biochemii - příklady
Plynová chromatografie
 standardní technika v kvalitativních i kvantitativních analýzách v toxikologii
– plynové chromatografy v toxikologických laboratořích vybaveny různými detektory
k různým typům analýz, např.
GC s plamenovým ionizačním detektorem - stanovení alkoholu a těkavých látek v krvi
NPD detektor - screening většiny léčiv či drog
detektor elektronového záchytu - analýze benzodiazepinů nebo halogenovaných látek
hmotnostní spektrometr - cílené průkazy a stanovení nox
 diagnostika dědičných metabolických poruch (GC / MS)
Organické kyseliny v moči – diagnostika dědičných metab. poruch
Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry)
MS - fyzikálně-chemická metoda – kvalitativní i kvantitativní analýza
 převedení molekul analytů na ionty
 separace iontů ve vakuu podle jejich hmotnosti při průchodu magnetickými a
elektrickými poli
• MS řazena mezi spektrální techniky, i když v principu se liší (nesleduje
rozdíly energetických stavů molekul)
 MS vyvinuta počátkem 20. století
 klinická biochemie – detekce a stanovení nízkomolekulárních látek ve spojení
s plynovou chromatografií (1980)
• 90. léta 20.století - nové techniky, které umožnily využívat metodu
• ve spojení s kapalinovou chromatografií
• pro látky vysokomolekulární
• samostatně bez napojení na separační techniku
Hmotnostní spektrum
Výstup MS - hmotnostní spektrum – čarový diagram
• Osa x - hodnota m/z (hmotnost / náboj iontu)
• Osa y - odezva detektoru nebo relativní zastoupení daného iontu (%)
Hmotnostní spektrometr
– převádí molekuly analytů na ionty
– separuje a rozlišuje ionty podle poměru hmotnosti a náboje (m/z)
– zaznamenává intenzity jednotlivých iontů
Složený ze tří funkčních celků:
Iontový zdroj:
• molekuly analytů převedeny do plynné
fáze (do vysokého vakua)
• přitom se ionizují
Iontový separátor:
• rozdělení iontů různých hmotností:
- ionty urychleny
- z charakteru pohybu vakuovaným
prostorem - vypočet jejich m/z
Detektor:
• detekce iontů podle hodnoty m/z
• určení intenzity (četnosti) iontů
Další části přístroje
- vakuový systém - zařízení pro zavádění vzorků (dávkovač)
- iontová optika k urychlení a fokusaci iontů - počítač na ovládání přístroje, sběr a ukládání dat
Iontový zdroj - Ionizační techniky
 Existuje celá řada ionizačních technik - vytvoření nabité částice, která je
následně analyzována
 Použitá technika záleží na
- charakteru analyzovaných látek
- separační metodě, na kterou je MS napojen (chromatografie,
elektromigrační techniky, bez napojení na separaci)
 GC/MS
 Elektronová ionizace EI
 Chemická ionizace CI
 LC/MS (CE / MS, MS s přímým nástřikem)
 ESI Elektrospray
 APCI Chemická ionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure
chemical ionization,)
 APPI Fotoionizace za atmosférického tlaku (atmospheric pressure
photoionization,)
 MALDI (SELDI) …a další
Elektronová ionizace, EI (GC / MS)
■ V iontovém zdroji - ionizace molekul analytu v plynném
stavu pomocí proudu elektronů
– odtržení elektronu z molekuly při srážce s paprskem
elektronů (molekula získává kladný náboj)
– následně dochází k fragmentaci (rozpadu) molekuly
přebytkem energie
EI - tvrdá ionizační technika (fragmentace)
 Příklad: fragmentace molekuly MeOH, hmotnostní spektrum
 fragmenty rozděleny v další části analyzátoru podle hodnoty m/z a detegovány
 EI - pouze pro teplotně stálé nízkomolekulární látky (50 – 800 Da)
Dalton – jednotka molekulové hmotnosti
Chemická ionizace CI (GC / MS)
■ „Měkčí“ varianta elektronové ionizace - šetrnější, nedochází k rozsáhlé fragmentaci
– do iontového zdroje je přiváděn ionizační plyn (př.metan)
– proud elektronů ionizuje nejdříve molekuly ionizačního plynu
– tyto předávají energii molekule analytu (M)
• Srovnání hmotnostního spektra při elektronové a chemické ionizaci
Elektrospray ionizace, ESI (LC / MS)
 „měkká“ ionizační technika
 převod kapalného vzorku do plynné fáze při současné tvorbě
(pseudo)molekulárních iontů
 eluát z kolony prochází kapilárou, na niž je vloženo
vysoké napětí
 vytváří se sprej vysoce nabitých kapiček
 odpařením rozpouštědla vznikají ionty
(i vícenásobně nabité)
 vhodná pro nízkomolekulární i vysokomolekulární látky
(peptidy, sacharidy, proteiny, nukleové kyseliny,...)
 Iontový separátor – kvadrupól, iontová past
Kvadrupól (iontový separátor)
 konstrukce - 4 kovové tyče připojené ke zdrojům stejnosměrného a střídavého napětí
 ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, začnou oscilovat
 při vhodné kombinaci obou složek napětí projdou kvadrupolem v daném okamžiku
pouze ionty o určitém poměru m/z
 změnou vkládaných napětí projdou postupně kvadrupolem postupně ionty v celém
rozsahu m/z
 lze použít pro GC/MS i LC/MS
Iontové pasti
stejné fyzikální principy jako kvadrupól
– regulace pohybu iontu v určitém prostoru elektrickými poli
Sférická iontová past
 omezuje pohyb iontu ve všech třech
směrech
 ionty se pohybují po určitou dobu v prostoru
iontové pasti
 vypuzovány z pasti selektivně podle hodnoty
m/z
Lineární iontová past
 podobný tvar jako kvadrupól
 na oba konce vkládáno elektrostatické pole zabraňuje
iontům opustit vnitřní prostor
Iontové pasti
Iontová cyklotronová rezonance s
Fourierovou transformací (FT - ICR)
 princip - pohyb iontu v magnetickém poli
• ion se v silném magnetickém poli pohybuje po
kruhové dráze s frekvencí ω
ω = B. z / m B...intenzita magnet. pole
 Fourierova transformace - frekvence ω
překonvertovány na hmotnostní spektrum
 extrémně vysoké rozlišení, velmi přesné měření
hmotnosti
Orbitrap
 nejnovější iontový analyzátor
 vysoké rozlišení
 ionty vlivem elektrických polí obíhají a oscilují
okolo centrální elektrody
 frekvence závislá na m/z
 oscilace snímají vnější detekční elektrody
 Fourierova transformace - konverze na hmotnostní
spektrum
Detektor
Fotonásobič
 před vlastním fotonásobičem umístěna
fosforová destička
 dopad částice z konverzní dynody na P-destičku
- emise fotonů
 dopad fotonů na fotokatodu - fotoelektrický jev emise
elektronů
 zmnožení elektronů stejně jako v elektronovém
násobiči
- detekce iontů po jejich separaci podle hodnoty m/z
- určení relativní intenzity (četnosti) jednotlivých iontů
Elektronový násobič
 série dynod se vzrůstajícím potenciálem
 ion narazí na povrch první dynody - emise elektronu
 dopad elektronu na další dynodu - vícenásobná emise
 kaskádový efekt - velké množství elektronů
 detekce
Tandemová hmotnostní spektrometrie, MS/MS
 ionty podrobeny dvěma (nebo více) hmotnostním analýzám
• zapojení dvou (nebo více) iontových separátorů v tandemu
 MS/MS - rychlá a citlivá analýza i bez použití separačních metod ve složité matrici
- MS1 - výběr iontů s určitou hodnotou m/z - prekurzorové (mateřské) ionty
- kolizní cela - fragmentace prekurzorových iontů – vznik produktových iontů
- MS2 - záznam spektra produktových (dceřinných) iontů
• různé režimy práce
- sken produktových iontů - charakterizace struktury
- sken prekurzorových iontů - pro analýzu určitých skupin látek
Trojitý kvadrupól QqQ - nejčastější
• Q1 - výběr prekursorového iontu
• q - kolizní cela - fragmentace srážkou
iontu s atomy inertního plynu
• Q2 - analýza fragmentů
Parametry hmotnostního analyzátoru
Rozlišení R
 základní parametr hmotnostního analyzátoru
 vyjadřuje schopnost analyzátoru rozlišit blízké hodnoty m/z
 nejmenší hmotnostní rozdíl dvou iontů, které lze ještě rozlišit, vztažený k velikosti m
R = (m1 – m2) / m1 m1, m2...hmotnosti 1. a 2. iontu (pro z1, z2 = 1)
 1/R = RP (Resolving power) 1/R může být 1 000 – 1 000 000
 spektra s nízkou RP - pouze rozlišení iontů lišících se o jednotku m/z
 spektra s vysokou RP - možnost určení elementárního složení jednotlivých
iontů
– např. pro nominální hmotu m/z = 28:
CO (27.9949) × N2 (28.0061) × C2H4 (28.0313)
Spektrum v tzv.
profilovém módu kontinuální
záznam ve
formě píků
(na rozdíl od běžného
čarového módu)
Příklady použití – GC/MS
 Pro analýzu neznámých složek směsi
- pro každou složku směsi se získá
hmotnostní spektrum
- Identifikace složky porovnáním s PC
databází spekter
 Potvrzení či vyloučení metabolitů
svědčících pro určité metabolické
onemocnění
 Kvantifikace určitých metabolitů
 Toxikologie – standardní metoda
• léky
• drogy
• jedy
Ukázka – organické kyseliny v moči
Příklady použití - LC/MS, LC/MS/MS
 Toxikologie – standardní metoda
• screening neznámých nox
• konfirmace a kvantifikace speciálních nox
 Farmakokinetické studie, stanovení léků
 Proteomika / metabolomika
Stanovení léků LC/MS (LC/MS/MS)
Pozn.: Záznam v SIM módu
(Selected Ion Monitoring):
- Hmotnostní detektor sleduje
pouze vybrané hmotnosti, nikoli
celé spektrum iontů
Příklady použití MS/MS
Novorozenecký screening dědičných poruch metabolismu
 Stanovení analytů ve výluhu ze suché krevní kapky
- koncentrace aminokyselin
- koncentrace acylkarnitinů
- 10 různých metabolických poruch
např. fenylketonurie
 MS/MS analýza bez použití separační metody (GC, LC)
- uspořádání ESI – trojitý kvadrupol
MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
 vzorek v roztoku smíchán s matricí
• deriváty nízkomolekulárních aromatických kyselin absorbují
energii laserového záření ve VIS nebo
blízké UV oblasti
 roztok nakápnut a vysušen (vykrystalizován) na MALDI
destičce ve formě spotu
 pulsní ozáření směsných krystalů zábleskem laseru prudké
odpaření látek do vakua
 ionizovaná matrice strhne sebou analyt
 ionizace molekul analytu ion-molekulárními reakcemi s
ionizovanou matricí
 ionty urychleny stejnosměrným
elektrickým polem do TOF
analyzátoru
Matrice
MALDI - Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
 Velmi měkká, šetrná technika
• i pro vysokomolekulární látky (proteiny, peptidy, oligosacharidy, nukleotidy)
Spotovací destička
Pozn.: Technika SELDI (Surface Enhanced Laser Desorption / Ionization)
- kombinace afinitního principu a ionizace MALDI
Ionizační techniky dle „tvrdosti“: ESI (nejšetrnější) < MALDI < CI < EI
Spotovací destička na monitoru
TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
 deteguje hmotnosti ionizovaných molekul na základě doby letu evakuovanou trubicí
• rychlosti letu závisí na hodnotách efektivní hmotnosti m/z
– lehčí molekula letí rychleji
t…čas L…délka dráhy
m…hmotnost iontu E…kinetická energie
 lineární nebo reflektronový mód (reflektron - vyšší rozlišovací schopnost)
TOF – analyzátor „Time of Flight“ (průletový)
 TOF teoreticky použitelný pro neomezený rozsah hmotností
 v praxi se mu dává přednost pro velké molekuly
 MALDI - TOF spektrometry - hlavně pro analýzu proteinů
 molekuly s hmotností až 100 000 Da
 TOF v kombinaci s EI nebo ESI - i pro menší molekuly, v jiném provedení
Bruker
Agilent Technologies
Příklady použití - MALDI-TOF
Analýza biomolekul
– proteiny
– peptidy
– oligosacharidy
– nukleotidy…
 Identifikace mikroorganismů
po extrakci proteinů z bakterií nebo i
metodou celých buněk
 MALDI - IMS (imaging mass spectrometry) zobrazení rozložení proteinů i
nízkomolekulárních látek ve tkáních přímou „in-situ“ analýzou
SELDI – Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
Analýza proteinů pomocí vazby na předpřipravený povrch pevné fáze proteinového čipu:
 kombinace afinitního principu a ionizace MALDI
 povrch čipu - tvořen protilátkou, receptorem, ligandem, chemickou úpravou…
 nanesení vzorku - navázání proteinů adsorpcí, el.-stat. interakcí, na afinitním principu,…
 promytí čipu - odstranění nenavázané složky
 Analýza – viz MALDI - TOF
 Vzorek - komplexní směs
proteinů může být
analyzován současně na
několika různých
sorbentech, aby byly
navázány a analyzovány
veškeré proteiny ve
vzorku
 Čipy mohou být vyrobeny
dle požadavku zákazníka
 Technologie Ciphergen
Děkuji za pozornost…
…ale i těm,
kteří se
nudili !
…těm, které
problematika
zajímala…